[发明专利]一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法

权利要求书

1.一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，包括以下步骤：

采集旱柳叶片，依次进行1)匀浆；2)过滤；3)粗沉淀制备；4)粗沉淀悬浮；5)预形成梯度；6)等密度离心；7)完整叶绿体回收。以上步骤均要求在4℃低温下进行。

2.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述1)匀浆，加入适当体积的分离液，严格控制匀浆时间和次数，尽量避免匀浆导致叶绿体被摸的破坏。

3.根据权利要求2所述的匀浆方法，其特征在于：取10g叶片转移到Waring Blender匀浆机中，加入200mL分离液，先低速2次再高速2次，每次5秒、间隔1分钟。

4.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述3)粗沉淀制备，是指将收集的滤液先在低离心力下离心，使使细胞壁和细胞核沉淀，再将上清液离心，获得叶绿体粗沉淀。

5.根据权利要求4所述叶绿体粗沉淀的获得方法，其特征在于：将滤液在200g下离心3min后取上清液，在1500g下离心10min，得到叶绿体粗沉淀。

6.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述4)粗沉淀悬浮，是在每个叶绿体粗沉淀离心管中加1mL悬浮液，在冰浴中充分悬浮，避免叶绿体颗粒间的粘附。

7.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述5)预形成梯度，是先配制等渗的30％Percoll梯度液，在离心场中离心，使其形成连续的密度梯度。

8.根据权利要求7所述的预形成梯度方法，其特征在于，将装有20mL30％Percoll的离心管置于角转子中，在40 000g下离心1h，离心机减速设定为No brake。

9.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述6)等密度离心，是指依据破碎叶绿体与完整叶绿体在梯度液中平衡时的密度差异，将二者在离心路径上分离。

10.根据权利要求9所述的等密度离心方法，其特征在于，将4mL叶绿体粗沉淀悬浮液铺在预形成梯度的30％Percoll上方，置于甩开转子中16 000g离心30min，离心机加速设定为5，减速为No brake。离心后得到2层绿色条带，上层为破碎叶绿体，下层为完整叶绿体。

11.根据权利要求1所述旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，其特征在于所述7)完整叶绿体回收，抽取下层绿色条带，用3倍体积的悬浮液稀释，在1500g下离心2min，获得完整叶绿体沉淀，再用一定体积的悬浮液悬浮，使叶绿素浓度约为500μg/mL。

12.权利要求1-10任一项所述的完整叶绿体的制备方法在旱柳叶片叶绿体制备中的应用。