[发明专利]一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法

说明书

本发明属于农业生物技术领域，公开了一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，包括以下步骤：采集旱柳叶片，依次进行1)匀浆，2)过滤，3)叶绿体粗沉淀制备，4)叶绿体粗沉淀悬浮，5)预形成梯度，6)等密度离心，7)完整叶绿体回收，最后得到完整叶绿体的悬浮液。采用本发明所述方法获得的叶绿体纯度高，被膜完整性可达到80％以上。本发明为在叶绿体水平上开展旱柳光合生理和分子生物学的研究奠定了基础，同时为其他木本植物细胞器的分离提供了一种新的思路。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及的是一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法。

背景技术

旱柳(Salix matsudana)为杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)植物，是我国北方地区重要的农田防护、平原造林和园林绿化树种，其生态适应性广泛，生产应用价值高。旱柳展叶早、落叶迟，叶片固定CO₂的年积累时间长，光合色素含量丰富，光能吸收、转化能力强，光合速率高，是开展木本植物光合生理研究的代表性树种。叶绿体是光合作用的基本结构单元。获得完整的叶绿体是开展叶绿体光合电子传递、碳同化、活性氧代谢、多肽转运及下游蛋白质组等组学研究的必要前提。植物材料不同，叶绿体的形状、体积、亚细胞器结构等存在明显差异，导致模式植物中成熟的叶绿体制备方法很难在林木上适用。因此，建立旱柳叶片完整叶绿体的制备方法，是开展旱柳光合作用运行机制研究的必要前提。

目前，尚无关于旱柳叶片完整叶绿体制备方法的公开报道。该发明为旱柳叶片完整叶绿体的制备提供了解决方案，并为其他木本植物完整叶绿体的获得提供了参考。

发明内容

本发明的目的在于建立旱柳叶片叶绿体的提取、纯化体系，提供一种完整叶绿体的制备方法，为开展叶绿体光合生理与分子生物学的研究奠定基础。

本发明提供了一种旱柳叶片叶绿体的制备方法，包括如下步骤：

采集旱柳叶片，依次进行1)匀浆；2)过滤；3)叶绿体粗沉淀制备；4)叶绿体粗沉淀悬浮；5)预形成梯度；6)等密度离心；7)完整叶绿体回收。以上步骤均要求在4℃低温下进行。

所述的叶片要求在清晨采集，或者在采集前将旱柳植株置于暗中12小时，以避免淀粉粒累积导致离心时破坏叶绿体被膜。

所述1)匀浆，是指将叶片置于匀浆机中，按照1∶20的重量体积比(重量单位为g；体积单位为ml)加入分离液进行匀浆，使叶绿体从细胞中游离。

所述2)过滤，是指将匀浆液经4层纱布过滤，去除匀浆后残留的组织残渣。

所述3)叶绿体粗沉淀制备，是指将收集的滤液分装在离心管中，先在低离心力下离心，使细胞壁和细胞核沉淀，然后取上清液，离心得到叶绿体粗沉淀。

所述4)叶绿体粗沉淀悬浮，是指在每管粗沉淀中加入1mL悬浮液，充分悬浮，避免叶绿体颗粒间的粘附。

所述5)预形成梯度，是指配制等渗的30％Percoll梯度液(体积比)，将其置于角转子中离心，使其形成连续的密度梯度。

所述6)等密度离心，是取4mL叶绿体粗沉淀悬浮液，在预形成梯度的30％Percoll上方铺层，置于甩开转子中离心，使破碎叶绿体与完整叶绿体分离。

所述7)完整叶绿体回收，是用注射器抽取密度梯度离心后得到的完整叶绿体条带，用悬浮液稀释后离心，得到完整叶绿体沉淀。

本发明的创新之处是公开了一种基于预形成梯度等密度离心的旱柳叶片完整叶绿体的制备方法。目前，国内外未见同类报道。

本发明可保证叶绿体的纯度、完整度符合下游光合生理和分子生物学实验的要求，并为其他木本植物细胞器的分离提供了一种新的思路。

附图说明

图1等密度离心前的铺层和离心后的叶绿体分层；