[发明专利]一种双比率型多功能高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用

权利要求书

1.一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤为：

（1）将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；

（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；

（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；

（5）将甲基吡啶和碘甲烷溶解于无水乙醚中，溶解浓度分别为1mol/L和0.6mol/L，遮光搅拌3～4h，析出粉红色固体，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤，烘干，用二氯甲烷重结晶，得产物5；

（6）将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，溶解浓度分别为0.0048 g/mL和0.0059 g/mL，混合均匀，加入哌啶，加入浓度0.1 mol/L，回流12h，旋蒸除去溶剂，固体用体积比2:1的二氯甲烷-甲醇洗脱剂洗脱，收集产物，旋蒸，得产物6；

（7）将产物6溶解于乙酸酐中，溶解浓度0.017g/mL，然后加入无水乙酸钠，加入浓度0.028g/mL，氮气保护下，80℃油浴1h，终止反应，减压蒸馏，加入乙酸酐同体积的二氯甲烷重结晶，有黄色晶体析出，过滤，真空干燥，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针；

具体合成路线图如下：

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2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针效果判断指标如下：

检测灵敏度: 检测限0.12μg/mL；

吸收波长改变：检测时紫外吸收向红光区移动110 nm；

颜色变化：日光灯下表现为由棕红变为紫色；紫外灯下表现为绿色向黄色转变；

双重定量校正：兼具荧光比率定量功能及紫外吸收峰比率定量功能；

光学机理指标：兼具荧光比率功能及吸收红移功能。