[发明专利]一种双比率型多功能高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种双比率型（紫外/荧光）多功能（比色/荧光/紫外）高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用。首先，由2,4‑二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；其次，由甲基吡啶和碘甲烷在无水乙醚反应得产物5；再次，将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，加入哌啶反应得产物6；最后，将产物6溶解于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。适用于生物样本中羧酸酯酶的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法及应用。

背景技术

羧酸酯酶在生物体内，特别是细胞中起着重要的生理调节作用，其浓度的高低可反映出机体或某些细胞的疾病状态，同时也与一些病变或代谢紊乱有着密切的关系。当前，关于羧酸酯酶检测方法的研究并不多见，所报导的检测方法多以荧光分子探针检测法为主。虽然这些方法有着各自的优点，但总的来说其检测限（0.5~1 μg/ml）还有待改善，定量方式均为荧光单一定量，并且没有双比率较正的功能。这会导致现有检测方法的检测限度低、结果定量不准确、检测方式单一、不利于肉眼监测等问题。这些问题对于细胞中痕量羧酸酯酶的检测来说是非常受限制的。（代表性文献Biosensors and BioelectronicsVolume 65, 15 March 2015, Pages 9–15； Sensors and Actuators B: ChemicalVolume 205, 15 December 2014, Pages 151–157）。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供本发明涉及一种双比率型（紫外/荧光）多功能（比色/荧光/紫外）高灵敏羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，制备得到的比率型荧光探针可应用于生物样本细胞微环境中羧酸酯酶检测，具精密度高、现象明显易观察、准确度高等优点，设备便捷易操作，可操作性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。

本发明技术方案如下：

一种双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，首先，由2,4-二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；其次，由甲基吡啶和碘甲烷在无水乙醚反应得产物5；再次，将产物4和产物5溶解于绝对乙醇中，加入哌啶反应得产物6；最后，将产物6溶解于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，即得双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针。

所述的双比率型多功能羧酸酯酶检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：

（1）将2,4-二羟基苯甲醛（2,4-Dihydroxybenzaldehyde）溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯（Diethyl glutaconate），溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2~5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；

（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100/mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；