[发明专利]一种间充质干细胞因子大规模制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）间充质干细胞的体外培养：选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；

（2）间充质干细胞因子的诱导分泌：当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；

（3）间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤5-8遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/60，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/40-1/60后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；

其中，所述诱导培养基由诱导剂和混合培养基配置而成，所述混合培养基由体积比为30-80:19.8-68.5:0.2-1.5的1500-3000mg/L的DMEM、0.01-0.03M的PBS缓冲液和150-300mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液组成，所述诱导剂包括的组分及各组分在诱导培养基中的浓度如下：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70μmol/L的L-维生素C；

所述诱导剂还包括如下浓度的组分：5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇盐酸盐；

间充质干细胞因子诱导分泌的具体方法如下：

当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加原培养基一半体积的诱导培养基至细胞工厂，继续培养72h；

其中，0-24h内培养条件为37℃、5%CO2、5%O2， 24-48h内培养条件为：37℃、5%CO2、20%O2；

48-72h内培养条件为：37℃、5%CO2、5%O2；于48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量诱导培养基；72h后收集全部诱导培养基。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞因子的大规模制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括间充质干细胞因子的冷冻干燥步骤，将间充质干细胞因子浓缩液用生理盐水稀释得到间充质干细胞因子生理盐水稀释液，添加冻干保护剂混合均匀，过滤除菌后-80℃冷冻，并进行真空干燥，得到的间充质干细胞因子冻干粉，-20℃保存。

3.如权利要求2所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括的组分及各组分在间充质干细胞因子生理盐水稀释液中的浓度如下：250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白。

4.如权利要求3所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂还包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黄体酮。

5.如权利要求1所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，间充质干细胞的体外培养包括如下步骤：

（1）将含有间充质干细胞的组织块，并装于培养瓶中，加入间充质干细胞无血清培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，保持培养瓶绝对静止培养5天，其后每3天换液；

（2）待细胞长至75-85%汇合度时，弃间充质干细胞无血清培养基，于非细胞培养面加入生理盐水洗涤两次，然后加入0.25%胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育3-5min，待细胞变圆后加无血清培养基，快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，沉淀加生理盐水再次洗涤并离心得细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬，细胞筛过滤，计数并以为1-2×104个/ml细胞浓度铺瓶，置37℃、5%CO2培养箱中传代培养；如此反复至细胞传代至4代；

（3）取经传代培养的第4代间充质干细胞细胞；按1-2×104/ml密度接种于细胞工厂进行扩增培养，培养条件为37℃、5%CO2、20%O2培养。