[发明专利]一种间充质干细胞因子大规模制备方法

说明书

本发明涉及一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括间充质干细胞的体外培养、间充质干细胞因子的诱导分泌及间充质干细胞因子的分离纯化三个步骤，其中间充质干细胞因子的诱导分泌步骤所需的诱导培养基由体积比为30‑80:20‑60:0.2‑1.5的DMEM、PBS缓冲液和L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成。本发明所提供的间充质干细胞因子大规模制备方法，采用单一样本来源大规模培养，保证批次产品均一性，间充质干细胞因子的诱导分泌阶段采用诱导培养基，刺激细胞因子的大量分泌，配方合理有效，整个制备过程条件稳定合理，适宜大规模生产。

技术领域

本发明属于细胞因子技术领域，特别涉及一种间充质干细胞因子大规模制备方法。

背景技术

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。

间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。当前，越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中其主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究表明，间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF血管内皮生长因子、bFGF碱性成纤维细胞生长因子、NGF神经生长因子、HGF肝细胞生长因子、IGF-1胰岛素样生长因子1、BDNF脑源性神经营养因子、GDNF胶质源性神经营养因子、IL-6白细胞介素6、IL-11白细胞介素11等。间充质干细胞分泌活性因子具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管再生、促进神经干细胞迁移和分化、促进轴突生长及突触连接形成及促进髓鞘形成的功能等，通过脑白质损伤的动物模型证实可以抑制宿主细胞及移植细胞凋亡、改善模型鼠的神经功能，通过心梗动物模型证实可以促进心功能恢复，通过皮肤损伤实验证实可以促进伤口愈合。

目前的间充质干细胞因子的制备方法的报道，如中国专利申请CN105543313A中公开的人源间充质干细胞因子及其制备方法，收集并合并P1-P5代细胞生长至汇合度75-85％时的上清液，并对上清液进行过滤和超滤得到细胞因子浓缩液即可，该方法未能提供有效的诱导培养基，诱导细胞因子分泌过程不够高效，得到的间充质干细胞因子数量较少，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，工艺不连续，极易导致样品受到不必要的污染，且多代收集的方法来制备细胞因子，产品均一性较难保证，分离纯化过程不具规模化，较难适应大批量生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种一种间充质干细胞因子大规模制备方法，建立完善样本采集规范，建立大规模细胞培养及诱导分泌细胞因子的制备工艺，设计一套高效连续分离纯化工艺，产品经真空冷冻干燥可长期保存。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：

1、间充质干细胞的体外培养：选取健康间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；

2、间充质干细胞因子的诱导分泌：当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；

3、间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤5-8遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/60，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/40-1/60后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；