[发明专利]一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法

权利要求书

1.一种rhKLK1的毕赤酵母高密度发酵方法，其特征在于：其发酵过程中：诱导阶段的甲醇流加速度为：5~11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25~28℃，所用培养基是40%-80%的BSM发酵培养基。

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述方法包含下述步骤：

步骤1）将rhKLK1毕赤酵母工程菌株划线YPD平板，30℃培养3-5天；

步骤2）将此复苏后的rhKLK1工程菌株单克隆接种于YPD液体培养基30℃培养至OD₆₀₀=6~8，即得到上罐种子液；

步骤3）将此种子液接种于发酵罐的BSM发酵培养基中，发酵40~72h即得到rhKLK1发酵液，发酵过程包括增殖阶段、限速生长阶段和诱导阶段，其中诱导阶段的甲醇流加速度：5~11mL/h^-1L^-1，诱导温度为：25~28℃。

3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：上述步骤3）中增殖阶段发酵温度为30℃，pH=6.0±0.2，转速=300rpm培养，DO值100%，添加PTM12mL/L，发酵20h；限速生长阶段，先以30ml/h^-1L^-1的速率补加50%甘油，2h，然后以60mL/ h^-1L^-1的速率补加50%甘油，4h；诱导阶段，调节pH=6.0±0.2，诱导温度：25~28℃，甲醇流加速度：5~11mL/h^-1L^-1，并维持DO值不高于30%，继续发酵至40~72h。

4.一种rhKLK1发酵液的纯化方法，所述纯化方法包含以下步骤：

步骤1）rhKLK1发酵液预处理：收集如权利要求1至3任一项所得到的rhKLK1发酵液低温高速离心收集上清，加入硫酸铵，终浓度为1.5M，0.22μm滤膜过滤；

步骤2）疏水层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理的发酵液上清上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化hK1洗脱峰；

步骤3）阴离子交换层析法纯化：平衡缓冲液平衡层析柱，预处理后上样，洗脱液梯度洗脱，收集低糖基化hK1洗脱峰。

5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述方法的步骤2）中，填料为PhenylSepharose 6 FF（HS），平衡缓冲液Buffer A为：20mM NaH₂PO₄，1.5M (NH₄)₂SO₄，pH=7.5；洗脱缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH=7.5，按照洗脱缓冲液Buffer B50%，70%，100%等度洗脱，主要收集70%洗脱峰。

6.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述方法的步骤3）中，填料为 QSepharose FF，平衡缓冲液Buffer B为：20mM NaH₂PO₄，pH=7.5，洗脱缓冲液Buffer C为：20mM NaH₂PO₄，1.5M NaCl，按照洗脱缓冲液Buffer C 17%，35%，100%等度洗脱，主要收集35%洗脱峰。