[发明专利]一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法

说明书

本发明涉及一种表达重组人激肽原酶‑1的重组菌株及其发酵和纯化工艺，以及一种针对上述重组菌株优化的BSM发酵培养基。本发明的发酵工艺诱导剂甲醇的添加量较低，发酵液中目的蛋白产量高且易于纯化，获得的激肽原酶主要是低糖基化产物，免疫原性低并便于药物质量控制；与已有激肽原酶发酵技术相比，克服了发酵体系中甲醇加入量过大，制备的激肽原酶活性较低，糖基化修饰较高等缺陷。除此之外，与现有激肽原酶发酵技术相比，发酵时间明显缩短，有效降低了生产成本，活性、产量均有50％以上的提高。

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种重组人激肽原酶-1(Recombinant humanKallikrein-1，以下简称rhKLK1)基因的重组菌株及其生产和纯化工艺。

背景技术

激肽释放酶－激肽系统(kallikreinkinin system，KKS)又称激肽系统，广泛存在于动物体内的多个系统，尤其是在心血管系统内分布更为密集。其主要成分为：激肽原(活性因子前体)、激肽原酶(活性因子前体的激活物，又称为激肽释放酶)、激肽(主要活性因子)、激肽酶(活性因子的灭活物)。正常情况下激肽生成后迅速被循环中的激肽酶灭活。

激肽原酶，又称激肽释放酶，是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。目前分为两类：血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)。两种酶在分子量大小、底物特异性、免疫学特征和释放出的激肽方面都不同。血浆激肽原酶参与血凝块的表面激活、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症过程。组织激肽原酶广泛存在于肾、胰腺、胃肠道黏膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽原酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织激肽原酶，并可释放至血液循环。组织激肽原酶基因是一类大的多基因家族，目前证明人组织激肽原酶基因家族至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。共分为五个亚系：第一组KLK4、KLK5、KLK14；第二组KLK9、KLK11、KLK15；第三组KLK10、KLK12；第四组KLK6、KLK13；最后一组KLK8和KLK1、KLK2、KLK3。而这15个基因中迄今为止只有KLKl、KLK2和KLK3具有特异性生物学功能，与疾病的研究较为深刻，其他基因的研究报道极少。

KLK1主要是通过低分子激肽原释放赖氨酰缓激肽即胰激肽原发挥其生物学功能。然而，KLK1不同的表达形式提示在不同类型细胞中该酶表现不同的专一性。KLK1除发挥其激肽原酶功能外，根据它在垂体和胰腺等组织的存在表明它能对肽类激素和生长素进行加工处理。KLK1能降解胰岛素原、LDL、心房尿钠素前体、凝乳酶原、血管肠肽、前胶元酶、血管紧张素原等。在每一类型细胞中KLK1都可能有单一的或多重的或常见的或独特的功能。但是，研究表明激肽释放才是最主要的生理功能，起到扩张毛细血管，改善微循环的作用，产生舒张毛细血管和扩张小动脉等药理作用。KLK2，KLK3和KLK1的天然底物不同，与KLK1相比，具有非常低的活性，而其他激肽原酶有的与生理过程有关，有的与疾病的病理过程有关，但无一具有特异性基质水解作用。

激肽原酶KLK1临床用于糖尿病并发症、高血压及急性缺血性脑卒中等疾病的治疗。较为常见的产品主要有两类：一类是从猪胰脏提取的激肽原酶(例如常州千红制药的“怡开”)，另一类是人尿激肽原酶(例如广州天普的“尤瑞克林”)，其主要由人尿中提取，上述产品均存在来源有限，生产工艺难以稳定可控，病毒污染风险，从而导致最终产品生产工艺复杂，批次生产一致性较差，成本较高。