[发明专利]SPOP及突变体表达的C4-2稳定细胞系及构建方法

权利要求书

1.SPOP野生型及突变1和突变体2表达的C4-2稳定细胞系，此C4-2细胞系构建中所用的质粒使用Ploc.rfp载体克隆，所述Ploc.rfp载体中分别克隆了SPOP野生型、突变体1质粒或突变体2基因；突变体1为SPOP野生型中第87位氨基酸Y转变N的突变质粒(Y87N)，突变体2为SPOP野生型中第133位氨基酸F转变L的突变质粒(F133L)。

2.一种权利要求1所述细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)首先，分别将SPOP野生型以及其突变体1和突变体2质粒克隆到Ploc.rfp的载体上，并分别加入3×Flag的融合标签；

(2)采用慢病毒包装体系，使用病毒包装质粒pVSVG和psPAX2、分别与SPOP野生型质粒、突变体1质粒及突变体2质粒分别共转染HEK293T细胞，质粒转染48-72h后分别收集HEK293T含有慢病毒的细胞培养液，用0.22μm的滤膜过滤除去细胞后，将滤液加入预先在细胞板中铺好的C4-2细胞中，同时加入终浓度4-5μg/mL的polybrene；12-24小时后C4-2细胞更换RPMI 1640培养基；

(3)C4-2细胞病毒感染48-72小时后，在感染后的细胞中加入终浓度8-12μg/mLblasticidin筛选，每36-72小时更换一次含终浓度8-12μg/mL blasticidin的培养基，并继续筛选；12-16天后得到筛选完成的SPOP野生型及其突变体1和突变体2高表达的C4-2细胞系。

3.根据权利要求2所述的构建方法，具体步骤如下：

(1)采用PCR方法扩增SPOP野生型以及突变体1和突变体2基因，PCR引物为：

SPOP-5’：GAC ATC GAT TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG ATG TCA AGG GTT CCA AGTCCT CCAC

SPOP-3’：CGGCT AGC TTA GGA TTG CTT CAG GCG TTT G

(2)将步骤(1)所得的PCR产物，通过电泳检测，并进行下一步的PCR反应；

(3)将产物稀释100倍，加入SPOP-3’和FLAG-5’引物，将3×FLAG标签加入到SPOP序列中去；并跑胶，将正确的条带切割下来，回收；

FLAG-5’：GCGGCCGC ATG GAC TAC AAA GAC CAT GAC GGT GAT TAT AAA GAT CAT GACATC GAT TAC

(4)Ploc.rfp载体和构建好的SPOP片段分别用Not I和Nhe I分别进行双酶切反应，37℃反应1小时，将酶切后的片段跑胶，回收正确的片段；

(5)T4连接酶反应，分别将切下来的Ploc.rfp载体和SPOP及其突变体1和突变体2片段在室温连接30分钟；

(6)将连接酶体系转入感受态细胞E.coli.DH5a中，热激，涂ampicillin板，37℃培养12-16小时后，分别得到长有SPOP野生型以及突变体1和突变体2菌斑的板；

(7)挑菌，用加入浓度为50-100μg/mL的ampicillin的LB培养基37℃摇12-16小时，用质粒提取试剂盒提取质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，HEK293T细胞转染以及前列腺癌C4-2细胞慢病毒感染，具体步骤如下：

(1)在10cm细胞培养皿中接种1-2×10⁶个HEK293T细胞；

(2)等HEK293T细胞贴壁后进行转染。使用转染试剂Thermo transfection reagent。10cm培养皿里分别转染3μg SPOP野生型质粒及其突变体1质粒和突变体2质粒，同时每个10cm培养皿里转染2.7μg psPAX2和0.3μg pVSVG质粒；

(3)六孔细胞培养板每个孔接种2-5×10⁵个C4-2细胞；

(4)收集HEK293T细胞含有病毒的培养基，0.22μm滤膜滤除细胞后，加入六孔细胞培养板的C4-2细胞中进行感染，同时加入4-5μg/mL的polybrene；

(5)C4-2细胞更换正常的RPMI 1640培养基进行细胞培养。

5.根据权利要求2所述的构建方法，前列腺癌C4-2细胞的筛选，具体步骤如下：

(1)感染后48-72小时开始用浓度为8-12μg/mL的blasticidin进行稳定细胞系的筛选，每36-72小时更换一次含浓度为8-12μg/mL的blasticidin培养基，持续12-16天；

将上述得到的细胞系用荧光显微镜进行绿色荧光蛋白的观察，以及通过Western blot实验进行SPOP野生型及其突变体1和突变体2高表达蛋白量的测定。