[发明专利]一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法

权利要求书

1.一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，其特征在于采用步骤如下：

(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各25～30g，用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；

(B)配制质量分数为5～7％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液3000～5400mL，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为4～6，等量分为三组备用；

(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:40～60的比例分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在30～50℃下搅拌40～50min，三组实验在相同条件下独立操作；

(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4000～5000r/min，温度为10～30℃，时间为25～30min；

(E)将质量分数为4～6％的亚硫酸氢钠、质量分数为2～5％的尿素以及质量分数为0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品50～100倍质量的混合溶液；

(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在90～110℃下反应3～5h后完成过滤；

(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始后的前10～12h，每隔1.5～2.5h换一次水，10～12h后每隔6～8h换一次水，70～72h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩15～20min，备用；

(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)浓缩后的三组样品分别用pH范围为3.0～5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液0.5～3.5mL和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液0.5～5.5mL，平衡缓冲液平衡15～20min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹；

(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5mL离心管中，每管加入300～400μL水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40～70μL，2～4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；

(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1～2μg，完全盖住胶粒冰浴40～50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h；

(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1～2mL离心管中，得到三组样品的原液；

(L)将质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10～30μL的混合液，将所述混合液分别加入到经步骤(J)处理后的离心管中，振荡洗涤15～25min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；

(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10～30μL，振荡洗涤5～15min，并超声4～6min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；

(N)将步骤(M)获得的三组样品的最终液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，分别加入质量分数为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液于-10～-30℃冻存；

(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以500～700nL/min的速度进行洗脱；

(P)将经步骤(O)洗脱的三组样品放入LTQ～Orbitrap XL质谱仪，使用正离子模式，离子间分辨率为50000～70000，每次扫描取强度最高的4～6个母离子进行二级质谱检测；

(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。

2.一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，其特征在于采用步骤如下：

(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各27g，用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；

(B)配制质量分数为6％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液4200mL，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为5，等量分为三组备用；

(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:50的比例分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在40℃下搅拌45min，三组实验在相同条件下独立操作；

(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4500r/min，温度为20℃，时间为27min；

(E)将质量分数为5％的亚硫酸氢钠、质量分数为3.5％的尿素以及质量分数为1％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品75倍质量的混合溶液；

(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在100℃下反应4h后完成过滤；

(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始后的前11h，每隔2h换一次水，11h后每隔7h换一次水，71h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩17min备用；

(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)浓缩后的三组样品分别用pH范围为4.2的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2mL和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液3mL，平衡缓冲液平衡17min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹；

(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5mL离心管中，每管加入350μL水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液55μL，3min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；

(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1.5μg，完全盖住胶粒冰浴45min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于30℃烘箱中孵育11h；

(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1.5mL离心管中，得到三组样品的原液；

(L)将质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成20μL的混合液，将所述混合液分别加入到经步骤(J)处理后的离心管中，振荡洗涤20min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；

(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液20μL，振荡洗涤10min，并超声5min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；

(N)将步骤(M)获得的三组样品的最终液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，分别加入质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液于-20℃冻存；

(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以600nL/min的速度进行洗脱；

(P)将经步骤(O)洗脱的三组样品放入LTQ～Orbitrap XL质谱仪，使用正离子模式，离子间分辨率为60000，每次扫描取强度最高的5个母离子进行二级质谱检测；

(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。