[发明专利]一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法

说明书

本发明公开了一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法。具体为将SEQ ID NO：1所示的HBc分别与荧光蛋白的肽段a和肽段b相连，构建得融合蛋白A和B，所述肽段a和肽段b连接共同组成荧光蛋白的全序列；将融合蛋白A和B通过克隆技术共转化同一受体细胞，用待检测药物处理上述转化的受体细胞，同时以未用药物处理的上述转化的受体细胞作为阴性对照；观察细胞中荧光蛋白的信号，如果无荧光蛋白信号或荧光信号低于阴性对照，说明待检测药物可以抗人乙肝病毒，如果荧光信号与阴性对照信号强度相当，说明待检测药物不可以抗人乙肝病毒。本研究通过设计并构建HBc与荧光蛋白的融合蛋白，利用荧光蛋白信号监测HBc组装的过程，简化药物筛选过程中的读出操作，提供了一种用于HBV抗病毒药物的高通量筛选方法。

技术领域

本发明涉及抗病毒药物筛选技术领域，具体地，涉及一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法。

背景技术

人乙型肝炎病毒感染是世界范围内的重要公共健康问题。急性乙肝病毒感染后，仍有8％左右发展为慢性乙肝感染，持续性HBV感染将导致肝硬化，甚至肝癌。我国是乙肝大国，乙肝病毒携带者接近1.3亿人，约占总人口的9％。尽管随着乙肝疫苗的大范围普及，新乙肝感染率得到有效控制，但乙肝携带人口基数大，防治乙肝成为我国公共健康问题的重中之重。乙肝传播途径主要通过垂直传播与水平传播。垂直传播是指母婴传播；水平传播主要通过血液传播。

尽管目前市场上有很多抗HBV药物，主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。其中核苷类似物通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生。逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物严重的副作用等问题也不容小觑。由于HBV逆转录酶体外表达并不产生酶活性，HBV逆转录酶抑制剂的母环结构主要通过对人免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录酶化合物改造修饰。针对HBV本身进行从头抗病毒药物研究成为一种迫切需求。想要获得从头抗病毒药物，必须先建立一种合适的药物筛选方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法。该方法筛选的药物能抑制HBV核心蛋白(HBc)的组装，可以从根本上达到抑制乙肝病毒的作用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO：1所示的HBc分别与荧光蛋白的肽段a和肽段b相连，构建得融合蛋白A和B，所述肽段a和肽段b连接共同组成荧光蛋白的全序列；将融合蛋白A和B通过克隆技术共转化同一受体细胞，用待检测药物处理上述转化的受体细胞，同时以未用药物处理的上述转化的受体细胞作为阴性对照；观察细胞中荧光蛋白的信号，如果无荧光蛋白信号或荧光信号低于阴性对照，说明待检测药物可以抗人乙肝病毒，如果荧光信号与阴性对照信号强度相当，说明待检测药物不可以抗人乙肝病毒。

在HBV病毒生活周期中，病毒包膜蛋白与肝脏细胞膜受体结合，病毒包膜与宿主细胞膜融合，病毒核心颗粒进入胞内并介导病毒基因组进入胞核，通过利用人肝脏细胞内聚合酶将dsDNA基因组补全并转化为cccDNA，cccDNA进一步转录出3.5kb，2.4kb，2.1kb及0.8kb的mRNA，以前基因组RNA(pgRNA)3.5kb为模板逆转录出基因组DNA并作为编码病毒核心蛋白(HBc)和聚合酶蛋白的模板；HBc多聚化包装乙肝DNA基因组形成包装核心颗粒；乙肝表面抗原HBsAg合成后在粗面内质网中多聚化，并转运至高尔基体前腔以包装核心颗粒，装配好的HBV颗粒与亚病毒颗粒转运至高尔基体进行HBsAg的糖基化修饰，最后分泌出宿主细胞而完成生活周期。病毒核心(HBc)颗粒的组装是HBV复制产生过程不可缺少的一步，如果HBc的组装受到抑制，HBV的基因组将不能完成包装从而阻断HBV的复制(见图1)。如何抑制HBc的组装，将是研发抗HBV药物的一个重要靶点。