[发明专利]一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）使用EDS₇₆作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清；

（2）提纯鸡抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清中的抗EDS₇₆免疫球蛋白，制得鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白和兔抗EDS₇₆免疫球蛋白；

（3）ELISA检测步骤：

a. 将鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白用包被液稀释，100 μL/孔，37 ℃下包被120 min；

b. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加封闭液 100 μL封闭60 min；

c. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加待检样品100 μL，37℃下作用60 min；

d. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的兔抗EDS₇₆免疫球蛋白100 μL，37℃下作用60 min；

e. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的HRP标记的羊抗兔的酶标抗体100μL，37℃作用90 min；

f. 甩弃液体，洗涤液洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液100 μL，37℃避光作用10 min；

g. 每孔加终止液100 μL，小心混匀，用酶标仪测OD₄₅₀值；

（4）临界值的确定

用步骤（3）所述的ELISA检测步骤测定30份阴性样品的OD₄₅₀值，计算测得平均值X为0.280，标准差S=0.017，取X+3S=0.331作为判定的临界值，当被检样品的OD₄₅₀值≥X+3S时，则判断其为阳性，当被检样品的OD₄₅₀值＜X+3S时则是阴性。

2.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的a步骤中，用包被液将鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白稀释20-80倍。

3.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的a步骤中，用包被液将鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白稀释40倍，鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白的浓度为18 μg/mL。

4.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的b步骤中，用抗体稀释液将兔抗EDS₇₆免疫球蛋白稀释80-200倍。

5.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的b步骤中，用抗体稀释液将兔抗EDS₇₆免疫球蛋白稀释160倍，兔抗EDS₇₆免疫球蛋白的浓度为8 μg/mL。

6.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的b步骤中的封闭液为质量百分比为1%的BSA-PBST。

7.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的e步骤中，用抗体稀释液将HRP标记的羊抗兔的酶标抗体稀释4000-6000倍。

8.根据权利要求1所述的鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的e步骤中，用抗体稀释液将HRP标记的羊抗兔的酶标抗体稀释5000倍。