[发明专利]一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：（1）使用EDS₇₆作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清；（2）提纯鸡抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清中的抗EDS₇₆免疫球蛋白，制得鸡抗EDS₇₆免疫球蛋白和兔抗EDS₇₆免疫球蛋白；（3）ELISA检测步骤；（4）临界值的确定：取X+3S=0.331作为判定的临界值。本发明既克服了传统方法操作繁琐、耗时费力、检出率低等缺点，又解决了只检查抗体不检查病毒所造成持续性感染动物漏检的问题，其特异性、交叉试验和重复性试验结果表明，它是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。

技术领域

本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法。

背景技术

产蛋下降综合综病毒（EDS₇₆）属于腺病毒科腺胸腺病毒属，在临床上可引起鸡、鸭、鹅等家禽的产蛋下降综合征（Egg Drop Syndrome），所以也叫产蛋下降综合征病毒或者EDS病毒。产蛋下降综合征是1976年荷兰学者Van Eck首次报道，所以也称EDS₇₆病毒。1977年分离到病原，现已在英、法、西德、意大利、比利时、西班牙、丹麦、瑞典、挪威、美国、日本、印度等世界上大部分国家发病并分离出病原。

EDS₇₆病毒是Ⅲ亚群禽腺病毒的惟一成员，尽管不同的分离毒的限制性核酸内切酶图谱分析有一定差异，该病毒只有一个血清型。在我国1992年李刚首先分离到病毒后，先后从发病鸡群和其他蛋禽类分离到多株病毒。近几年全国疫病普查中，各个地区都有不同程度的阳性感染。近来有关EDS₇₆的研究已经在病原学、流行病学、分子生物学以及作为活载体等方面取得重大的成果。

目前对该病毒的检测方法有病毒的分离培养、琼脂扩散试验、中和试验、PCR检测等，病毒分离诊断比较可靠，分离概率低而且耗时费力；琼扩检测简便快速，可是检出率低，容易漏检；中和试验操作复杂，耗时长不能早期诊断；PCR 检测的不稳定性、非特异性是一个不容忽视的事实。

发明内容

为了解决上述问题，以便于更简便、快速地对大量样品进行EDS₇₆病毒的检测，本发明提供一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种鸡产蛋下降综合症病毒双抗体夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：

（1）使用EDS76作为抗原对产蛋鸡和雄性健康成年兔进行免疫，制备鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清；

（2）提纯鸡抗EDS76血清和兔抗EDS76血清中的抗EDS76免疫球蛋白，制得鸡抗EDS76免疫球蛋白和兔抗EDS76免疫球蛋白；

（3）ELISA检测步骤：

a. 将鸡抗EDS76免疫球蛋白用包被液稀释，100 μL/孔，37 ℃下包被120 min；

b. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加封闭液 100 μL封闭60 min；

c. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加待检样品100 μL，37℃下作用60 min；

d. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的兔抗EDS76免疫球蛋白100 μL，37℃下作用60 min；

e. 甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干，每孔加稀释好的HRP标记的羊抗兔的酶标抗体100μL，37℃作用90 min；