[发明专利]DNA文库的制备方法以及试剂盒

说明书

本发明提供了一种DNA文库制备及特异捕获的方法以及试剂盒，所述方法适用于cfDNA、白细胞gDNA、以及来源于组织样本的DNA文库的构建及特定靶基因区域的杂交捕获。在本发明DNA文库的制备方法中，末端修复以及3’端加A在同一个反应体系中进行，并改进了杂交投入量，对杂交捕获中的阻断制剂进行优化，由此获得了更高的捕获效率、更高的文库多样性、以及更均一的覆盖度，尤其适合微量以及低丰度突变的样本文库的构建，有利于实现技术流程上的节约。本发明的方法能够便于实现靶基因的所有类型的变异，如突变、缺失、插入、融合、以及拷贝数扩增的检测，克服了目前在DNA水平上通过PCR的方法富集靶基因序列，但只能检测靶基因的突变和缺失，无法检测融合的缺点。

技术领域

本发明涉及DNA文库的制备及靶向捕获方法以及试剂盒。尤其涉及血浆游离DNA文库、白细胞gDNA文库或组织来源的DNA文库的制备及靶向捕获方法以及试剂盒。

背景技术

研究发现，癌症患者血液中存在少量的游离DNA，即血浆游离DNA(cfDNA)，而这些游离DNA中有一部分是来自于肿瘤细胞，这部分游离于血液中的肿瘤基因组片段被称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA作为一种新的肿瘤标志物，在肿瘤的个体化用药检测、复发及疗效监测等方面发挥着重要的作用。通过检测从肿瘤组织释放到血液中的ctDNA以获得癌症相关基因变异信息的方法，即为“液体活检”。近年来基于ctDNA的液体活检概念逐渐被医生们所接受和认可。它不仅可以辅助诊断实体瘤，而且能够实现耐药复发监测，疗效评估，是组织活检的有力补充。

基于全基因组建库后探针捕获的二代测序法技术，能实现多基因多靶点的平行检测，且拥有极高的敏感性与特异性，能实现ctDNA的液体活检。因此，基于二代测序技术的ctDNA文库的构建对于实现液体活检以及肿瘤的辅助诊断、临床指导用药等都具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种DNA文库的制备方法以及试剂盒，所述方法适用于cfDNA、白细胞gDNA、以及来源于组织样本的DNA文库的构建。本发明的方法能够便于实现靶基因的所有变异类型，如突变、缺失、插入、融合、以及拷贝数扩增的检测，克服了目前在DNA水平上通过PCR的方法富集靶基因序列，但只能检测靶基因的突变和缺失，无法检测融合的缺点。

本发明的DNA文库制备方法，是在SureSelect XT的建库方法基础上，对预文库以及终文库构建过程中的细节进行了改进，例如末端修复以及3’ 端加A在同一个反应体系中进行，改进杂交投入量、并对杂交捕获截断的阻断制剂进行优化，由此获得了更高的捕获效率，更高的文库多样性，和更均一的覆盖度，适合于微量以及低丰度突变的样本文库的构建，并实现了技术流程上的节约。本发明一方面涉及DNA文库的制备方法，其包括预文库和终文库的制备过程，其中所述的预文库制备过程包括DNA的制备、末端修复和3’端加A，接头连接，接头连接产物纯化，预文库扩增，扩增的预文库纯化，所述的终文库制备过程包括预文库杂交，捕获洗脱，终文库制备，以及终文库纯化过程，其中所述DNA文库为cfDNA文库、白细胞gDNA文库或组织来源的DNA文库。

根据本发明第一方面任一项的制备方法，其中所述的末端修复和3’端加A是在一个反应体系中进行。

根据本发明第一方面任一项的制备方法，其中末端修复和3’端加A的反应体系含有ER&AT缓冲液，ER&AT酶，以及cfDNA，并且ER&AT缓冲液：ER&AT酶：cfDNA的体积比为7：3：50。

根据本发明第一方面任一项的制备方法，其中末端修复和3’端加A的反应体系条件为：

20℃ 30分钟(85℃热盖)

65℃ 30分钟(85℃热盖)

4℃ 维持。

根据本发明第一方面任一项的制备方法，其中预文库杂交过程中所用的阻断剂为双向短链阻断剂。