[发明专利]一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种基于端通用探针技术的荧光定量PCR方法，其特征在于：

基于端通用探针的荧光定量PCR反应分为两个阶段，第一个阶段为普通PCR反应，引物包括，上游组合特异引物，下游特异引物，反应条件同于一般PCR反应；第二阶段为荧光定量PCR反应，利用第一阶段的PCR纯化产物作为模板，引物有中间特异引物，上游通用引物和端通用探针，反应条件同于一般荧光定量PCR反应；

所述上游组合特异引物，该引物分为三部分，5’端为15个碱基左右的与上游通用引物相同的序列，中间为20个碱基左右的与端通用探针反向互补的序列，3’端为与模板DNA结合的上游特异引物序列；所述上游组合特异引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；

所述下游特异引物，该引物同于一般PCR引物，是与模板DNA结合的下游特异引物序列，与上游组合特异引物搭配，完成第一阶段PCR反应，产物长度在70-2000bp之间为佳；所述下游特异引物序列如SEQ ID NO:3所示；

所述端通用探针，该通用探针基于Taqman探针原理，一端为荧光基团，另一端为淬灭基团，其序列与上游组合引物的一段序列反向互补，以使得在第二阶段由中间特异引物引发水解而产生荧光；所述端通用探针序列如SEQ ID NO:5-6所示；

所述上游通用引物，是一段15个碱基左右的固定序列的引物，与上游组合特异引物的5’端序列相同，作为第二阶段的上游引物与中间特异引物配合完成第二阶段的PCR反应；所述上游通用引物序列如SEQ ID NO:4所示。