[发明专利]一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及荧光定量PCR领域，提供了一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法，该方法既有Taqman探针特异性高的优点，又降低了开发成本，具有良好的推广价值。两种通用探针技术是本发明的核心部分，端通用探针技术的探针为双标记探针，探针与上游组合特异引物的特定序列互补，中间特异引物起到类似Taqman探针特异性的作用，并引发探针的水解和信号释放。中间通用探针技术的探针为3’端单标记荧光探针，探针与中间组合特异引物的特定序列互补，中间组合特异引物起到类似Taqman探针特异性的作用，同时该引物5’端标记有淬灭基团，当该引物在PCR反应中水解后，淬灭基团游离，探针的信号即可释放。

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR领域，特别是涉及荧光探针技术的优化，利用一个或少数几个通用探针联合中间特异引物，即可做到荧光定量PCR反应的特异性，并降低了实验成本。

背景技术

荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新的核酸定量实验技术，它的原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，通过对产物量的实时分析，最终能够对模板的初始浓度，核酸种类、基因突变类型等信息作出准确的判定。目前，荧光定量PCR在生物学研究及个体化医学基因检测领域有着广泛的应用，其最特异的核酸标记方法为荧光探针标记法，即Taqman探针法，该标记方法特异性强，实验结果稳定性好，不易产生假阳性，是荧光定量PCR用于医学基因检测的首选核酸标记方法。然而Taqman探针合成费用较高，当检测多个位点或基因时，需要合成多条Taqman探针，将增加大量的实验成本，这也是限制荧光定量PCR技术临床推广的主要原因。本专利就针对这一现象，设计了两种类型的通用探针，分别结合于上游引物或中间特异引物上，所有荧光定量PCR实验都可利用已有的通用探针进行，这将大大降低研发和生产成本，有利于荧光定量PCR在医学基因检测领域的应用。

发明内容

本发明提供了一种基于通用探针技术的荧光定量PCR方法，提出了两种通用探针技术，分别是端通用探针技术和中间通用探针技术，以用于不同检测目的的需要。

两种通用探针技术是本发明的核心部分，它既包含了基于Taqman探针荧光定量PCR特异性高的优点，又弥补了其开发成本高、反应条件优化复杂等的缺陷。端通用探针技术所涉及的探针为双标记探针，原理同于Taqman探针，只是把探针结合的序列转移至上游组合特异引物上，同时设计一条中间特异引物，该引物起到类似Taqman探针特异性的作用，由这条特异引物引发端通用探针的水解，以实现荧光信号的释放。中间通用探针技术所涉及的探针为3’端单标记荧光探针，探针结合的序列在中间组合特异引物上，中间组合特异引物具有与模板结合的特异序列，起到类似Taqman探针特异性的作用，同时该引物5’端标记有淬灭基团，当该引物在PCR反应中水解后，淬灭基团游离，与之结合的通用探针荧光信号即可释放。

基于端通用探针的荧光定量PCR反应分为两个阶段，第一个阶段为普通PCR反应，用到的引物为上游组合特异引物和下游特异引物，反应条件与一般PCR反应相同；第二阶段为荧光定量PCR反应，模板是经核酸外切酶纯化或琼脂糖凝胶纯化后的第一阶段的PCR产物，引物有中间特异引物，上游通用引物和端通用探针，反应条件同于一般荧光定量PCR反应。

基于端通用探针的荧光定量PCR反应可以用于基因突变的检测，在该应用中，上游组合特异引物的3’端的碱基可以按照ARMS-PCR引物的设计方法进行设计，这样在第一阶段的同一个反应体系中，可以混合同一位点两种及两种以上的基于ARMS方法设计的上游组合特异引物，也可以混合不同位点的两种及两种以上的基于ARMS方法设计的上游组合特异引物，不同位点的上游组合特异引物的通用探针反向互补序列也各不相同，以便在第二阶段中利用反应管中特定的中间特异引物引发不同通用探针水解产生的荧光信号进行突变位点的鉴别，实现在一管中鉴别同一位点基因突变的基因型及突变比例，提高了ARMS-PCR方法的准确度和灵敏度。