[发明专利]一种人神经生长因子类似物及其制备方法有效
申请号: | 201611160674.3 | 申请日: | 2016-12-15 |
公开(公告)号: | CN106749605B | 公开(公告)日: | 2019-12-24 |
发明(设计)人: | 汤华东;万滔;刘娜;梅芸;李玉薇;陈亚 | 申请(专利权)人: | 武汉海特生物制药股份有限公司 |
主分类号: | C07K14/48 | 分类号: | C07K14/48;C12N15/12;C12N15/70 |
代理公司: | 11228 北京汇泽知识产权代理有限公司 | 代理人: | 程殿军;张瑾 |
地址: | 430056 湖北省武汉市经*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 人神经生长因子 类似物 重组人神经生长因子 大肠杆菌表达系统 正常氨基酸序列 大肠杆菌 甘氨酸残基 表达体系 融合蛋白 表达量 高活性 可溶 制备 | ||
本发明公开了一种人神经生长因子类似物及其制备方法。该类似物比人神经生长因子正常氨基酸序列的N末端多1个甘氨酸残基(G),使其在大肠杆菌中的稳定性和表达量得到明显提高,同时在选用融合蛋白表达体系时更有利于操作控制,从而实现重组人神经生长因子在大肠杆菌表达系统中的稳定、可溶及高活性的表达。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及一种人神经生长因子类似物及其制备方法。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是最早发现和最典型的神经营养因子,同时也是神经系统中最重要的生物活性分子之一。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。目前NGF已被开发成治疗外周神经损伤的药物应用于临床,并广泛应用于神经损伤、偏瘫、卒中、颅脑损伤、小儿脑瘫等神经性疾病领域。但目前,商品化的NGF为鼠源性神经生长因子(mNGF),潜在免疫原性风险。天然的人神经生长因子(hNGF)分布于人体的脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织,原料来源有限,且其中hNGF含量低,分离纯化极其困难,无法直接提取获得。
hNGF基因位于1号染色体短臂上,完整的hNGF外显子编码241个氨基酸组成的hNGF前体,通常称为preproNGF,在内质网中preproNGF的信号肽(pre部分)被切割下来,生成hNGF原体,即proNGF(由223个氨基酸组成),然后被转运至高尔基体内,再经蛋白酶酶切去除前导肽(pro部分),生成hNGF成熟肽(由120个氨基酸组成),被转运至细胞外,发挥生理功能。
在各大表达系统中,大肠杆菌表达系统因其表达水平高、生产成本低、便于工业化生产等优势成为制备重组人神经生长因子的首选。但目前存在的主要问题是:hNGF难于在大肠杆菌表达系统中实现重组人神经生长因子的稳定、可溶及高活性的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人神经生长因子类似物,具有与天然hNGF一致的免疫活性和生物活性,其避免了现有的鼠源性神经生长因子mNGF免疫原性风险问题。
本发明的另一个目的在于提供一种人神经生长因子类似物的制备方法,解决了重组人神经生长因子难于在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性表达的技术难题。
为实现本发明的目的,采用以下技术方案:
一种人神经生长因子类似物(GhNGF),所述的人神经生长因子类似物含人神经生长因子正常氨基酸序列及其N末端增加一个甘氨酸残基。
如上所述的人神经生长因子类似物,优选地,所述人神经生长因子正常氨基酸序列为天然人神经生长因子氨基酸序列,或者具有与天然人神经生长因子氨基酸序列95%以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。
如上所述的人神经生长因子类似物,优选地,所述人神经生长因子类似物含如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。
如上所述的人神经生长因子类似物,优选地,用于编码所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第331~693位所示或其互补序列。
一种人神经生长因子类似物的制备方法,优选地,将改造的人神经生长因子原体(proNGF)cDNA插入原核表达载体,构建成重组表达载体,采用大肠杆菌表达系统表达制备;其中,所述改造的人神经生长因子原体(proNGF)cDNA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3中第8~231位所示序列,或者与其氨基酸序列同源性大于90%的序列。
如上所述的制备方法,优选地,所述原核表达载体为融合蛋白表达载体,为pMAL载体、pGEX载体或pET载体。
如上所述的制备方法,优选地,所述pMAL载体为pMAL-p5x、pMAL-p5E、pMAL-p5G,所述pET载体为pET39b或pET32a。
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