[发明专利]全人源抗CD19单克隆抗体及其生产方法

权利要求书

1.一种全人源抗CD19单克隆抗体，包括人来源的轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区包含序列表SEQ ID NO:2所示的CDR L1，SEQ ID NO:4所示的CDR L2，SEQ ID NO:6所示的CDR L3序列；所述重链可变区序列SEQ ID NO:10所示的CDR H1，SEQ ID NO:12所示的CDR H2及SEQ ID NO:14所示的CDR H3序列。

2.根据权利要求1所述的全人源抗CD19单克隆抗体，其特征在于：包含如序列表SEQ ID NO:8所示的VH序列及SEQ ID NO:16所示的VL序列。

3.根据权利要求1或2所述的全人源抗CD19单克隆抗体，其特征在于：所述全人源抗CD19单克隆抗体为单链抗体，其序列由一段linker序列将所述VH，VL连接，连接方式为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。

4.根据权利要求3所述的全人源抗CD19单克隆抗体，其特征在于：linker序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

5.根据权利要求3所述的全人源抗CD19单克隆抗体，其特征在于：Linker序列为(GGGGS)_n，其中n为自然数。

6.根据权利要求3所述的全人源抗CD19单克隆抗体，其特征在于：该CD19单链抗体(scFv)序列如序列表SEQ ID NO:20所示。

7.一种编码上述CD19全人源抗体的核苷酸序列，其特征在于，编码该抗体轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示的CDR L1，SEQ ID NO:3所示的CDR L2，SEQ ID NO:5所示的CDR L3序列，编码该抗体的重链可变区核苷酸包含SEQ ID NO:9所示的CDR H1，SEQ ID NO:11所示的CDR H2，SEQ ID NO:13所示的CDR H3序列。

8.一种如权利要求3所述的全人源抗CD19单克隆抗体的制备方法：其特征在于，包括如下步骤：

重组质粒pEF-2A3转染HEK293T细胞

转染前一天向T175瓶中接种HEK293T细胞，第二天在细胞密度大约为80％时进行转染：首先取无血清培养1.5ml中加入质粒60ug；其次再取无血清培养基1.5ml加入120ul Lipofectamine2000脂质体转染试剂；将质粒和脂质体溶液混合均匀，室温静置15分钟后加入细胞培养基中；6小时后培养基换为新鲜的DMEM+10％FBS培养基；72小时后收取培养上清，上清中即含单链抗体。

9.根据权利要求8所述的全人源抗CD19单克隆抗体的制备方法,其特征在于：进一步包括单链抗体2A3的纯化：首先向重力柱中加入500ul镍填料悬浊液，待液体流干后向其中加入10ml PBS平衡体系；将培养基上清加入重力柱中，使其自然流出；随后使用10mM，20mM,50mM咪唑的PBS进行洗涤，以洗去杂蛋白；最后用500ul含200mM咪唑的PBS洗脱单链抗体；之后将所得单链抗体加入脱盐柱中，离心以除去咪唑，最终得到纯化的全人源CD19单链抗体。

10.根据权利要求9所述的全人源抗CD19单克隆抗体的制备方法,其特征在于：进一步包括全人源CD19单链抗体的检测：使用考马斯亮蓝染色以及免疫印迹分别检测目的蛋白的表达；样品：pEF空载体转染细胞上清，pEF-2A3转染细胞上清，纯化后的单链抗体2A3上样并进行SDS-PAGE电泳，电泳之后进行考马斯亮蓝染色或者进行免疫印迹，使用HA抗体检测单链抗体2A3的表达。