[发明专利]全人源抗CD19单克隆抗体及其生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物免疫领域，具体地，本发明涉及一种全人源CD19单克隆抗体。

背景技术

CD19是重要的B细胞恶性肿瘤的靶点。CD19几乎表达在B细胞发育的所有时期，以及各种B细胞肿瘤中，但是，重要的是CD19并不表达在多能性造血干细胞上。这些特点使得CD19成为了很好的B细胞肿瘤的靶点。虽然靶向CD19会摧毁正常B细胞，但是，这一缺陷能够被患者很好的耐受。当前靶向CD19的单抗，嵌合抗原受体或者是双特异性抗体均采用的是鼠源或者人源化的序列。但是鼠源或者人源化的序列中含有的鼠源成分可能会引起引起人抗鼠抗体(HAMA，human antimouse antibody)反应，导致抗体效力的降低，甚至带来严重的副反应。因此开发新型的全人源CD19抗体或者是scFv有迫切需要。

单链抗体(single—chain antibody fragment，scFv)是单克隆抗体的一种形式，通过将抗体的可变区通过铰链区相连接，形成了单链可变区，也称为单链抗体。scFv保留了抗体的抗原结合能力的最小单位。由于其结构更小，更利于基因工程操作，所以被广泛用于人源抗体的构建、筛选和应用。例如CAR-T技术就采用scFv结构的抗体做为嵌合受体识别抗原的区域；也可以通过两个scFv串联形成双特异性抗体。另外由于scFv包含了抗体结合抗原的所有序列，可以轻易的通过基因工程手段将其改造为传统结构的抗体，例如通过加入CL,CH1，CH2，CH3等区域改造为不同类型的IgG抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全人源抗CD19单克隆抗体，包括人来源的轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区包含序列表SEQ ID NO:2所示的CDR L1，SEQ ID NO:4所示的CDR L2及SEQ ID NO:6所示的CDR L3；所述重链可变区序列包含SEQ ID NO:10所示的CDR H1，SEQ ID NO:12所示的CDR H2及SEQ ID NO:14所示的CDR H3。

优选地，所述的全人源抗CD19单克隆抗体包含如序列表SEQ ID NO:8所示的VH序列及SEQ ID NO:16所示的VL序列。

优选地，所述全人源抗CD19单克隆抗体为单链抗体，其序列由一段linker序列将VH,VL连接，连接方式为VH-Linker-VL，或VL-Linker-VH。

优选地，所述linker序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

优选地，所述Linker序列为为(GGGGS)_n，其中n为自然数。

优选地，所述的全人源抗CD19单克隆抗体的CD19单链抗体(scFv)2A3序列如序列表SEQ ID NO:20所示。2A3序列通过全人源scFv噬菌体展示文库筛选获得。通过IMGT V-QUEST分析其人源胚系序列的来源见表1。

表1：CD19scFv2A3胚系基因来源

一种编码上述CD19全人源抗体的核苷酸序列，其特征在于，编码该抗体轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示的CDR L1，SEQ ID NO:3所示的CDR L2，SEQ ID NO:5所示的CDR L3,编码该抗体的重链可变区核苷酸包含SEQ ID NO:9所示的CDR H1，SEQ ID NO:11所示的CDR H2及SEQ ID NO:13所示的CDR H3。

一种全人源抗CD19单克隆抗体的制备方法：包括如下步骤：

重组质粒pEF-2A3转染HEK293T细胞

转染前一天向T175瓶中接种HEK293T细胞，第二天在细胞密度大约为80％时进行转染。首先取无血清培养1.5ml中加入质粒60ug；其次再取无血清培养基1.5ml加入120ul Lipofectamine2000脂质体转染试剂；将质粒和脂质体溶液混合均匀，室温静置15分钟后加入细胞培养基中；6小时后培养基换为新鲜的DMEM+10％FBS培养基；72小时后收取培养上清。上清中即含单链抗体。