[发明专利]类角膜内皮细胞的获取方法

权利要求书

1.类角膜内皮细胞的获取方法，其特征在于，步骤如下：

(1)拟胚体的获取：将商品化的人类胚胎干细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞上，用胶原酶Ⅳ和DispaseII铺满培养器皿进行消化后，采用无血清培养基培养，以获取拟胚体；

(2)预分化培养：将步骤(1)获取的拟胚体采用补充了头蛋白和TGF-β1受体抑制剂的分化培养基A中培养4天，即获得预分化培养中间细胞；

(3)分化培养：将步骤(2)预分化培养后中间细胞转移至包被了硫酸软骨素和层粘连蛋白的培养器皿中，采用分化培养基C培养7天，即获得类角膜内皮细胞；

步骤(1)中所述的胶原酶Ⅳ和中性蛋白酶DispaseII的配比是1：1～5，其中配置前，胶原酶Ⅳ的浓度为400-1000U/mL，中性蛋白酶DispaseII的浓度为1～6U/mL；

无血清培养基：基础培养基为DMEM/F12培养基，并添加了10％～20％的血清替代物，10～20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培养基及添加剂，100单位/mL的青-链双抗，0.1mM的β-巯基乙醇；

所述的步骤(2)中补充头蛋白后的浓度是300～1000ng/mL；补充TGF-β1受体抑制剂后的浓度是2.5～15μM；

步骤(2)中所述分化培养基A：基础培养基DMEM/F12培养基，添加了1×N2添加剂，10～20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培养基及添加剂，100单位/mL青-链双抗，2～10ng/mL重组人胰岛素；

步骤(3)中所述分化培养基C：基础培养基由DMEM/F12和M199以1～1.5:1的比例配制而成，并添加了5～20％胎牛血清，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培养基及添加剂，100单位/mL青-链霉素青链双抗，2～10ng/mL重组人胰岛素，20～50mg/mL左旋维生素C，10～20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述类角膜内皮细胞的获取方法，其特征在于：所述的步骤(3)培养器皿包被的硫酸软骨素浓度为10～50mg/mL；层粘连蛋白浓度为1～10μg/mL。

3.根据权利要求1所述类角膜内皮细胞的获取方法，其特征在于：将预分化培养所获取的中间细胞的标志物HNK-1和P75免疫荧光染色呈阳性表达；获取的类角膜内皮细胞的标志物钠-钾-ATP酶、S100A4蛋白、水通道蛋白-1即AQP-1和紧密连接蛋白ZO-1免疫染色呈阳性表达。