[发明专利]类角膜内皮细胞的获取方法

说明书

本发明涉及一种类角膜内皮细胞的获取方法，属于细胞生物技术领域。其通过拟胚体的获取、预分化培养和分化培养获得类角膜内皮细胞。本发明提供的通过体外分化人类多能干细胞的方法获得类角膜内皮细胞，可以作为替代捐赠的角膜内皮细胞的理想细胞来源。本发明方法采用商业化的人类胚胎干细胞，因为其具有自我复制和无限增殖的能力以及分化潜能，因此类角膜内皮细胞的获得具有充足的来源。本发明解决了类角膜内皮细胞在体外分化比率低的问题，提高了类角膜内皮细胞在体外分化效率，自拟胚体阶段至获取类角膜内皮细胞时间最快为11天。本发明方法技术方案简便、易操作。

技术领域

本发明涉及一种类角膜内皮细胞的获取方法，属于细胞生物技术领域。

背景技术

角膜内皮细胞是一个有规律六边形排列的单层细胞，是角膜基质与房水前房隔开的生理屏障，并在保持角膜透明度方面发挥关键作用。角膜内皮细胞减少或损伤的原因有：①随着年龄的增加逐渐减少；②感染、炎症、外伤(如机械伤、化学伤、产伤、激光射线等)、眼部手术(如白内障手术，抗青光眼手术，及其他眼内操作如前房异物取出等)、遗传性疾病、代谢性疾病等都可引起内皮细胞的减少和损伤。因为成体角膜内皮细胞没有增殖能力，受损后主要依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复，当角膜内皮细胞的密度变得极低，内皮细胞障碍物和泵的功能将不足以维持适当的基质水合作用，导致角膜失代偿或大疱性角膜病变或角膜水肿，患者视力受损并最终视力丧失。

临床上，角膜移植是治疗人类角膜内皮细胞疾病唯一有效的疗法。但是角膜供体来源匮乏是全世界面临的难题，极大地限制了角膜移植手术的开展，使众多角膜病患者不能得到及时医治，只能在痛苦中等待角膜材料，带来极大的社会负担。近年来，随着角膜移植技术的进步，Descemet膜技术(DMEK)的开发，即只有角膜内皮和Descemet膜来实现良好的视力恢复技术。然而，这种疗法显著限制于角膜内皮细胞捐赠来源的短缺。因此，基于干细胞的技术被认为是替代治疗人角膜内皮细胞缺失引起的疾病的一种很有前途的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供了体外分化人类多能干细胞获取类角膜内皮细胞的方法。

本发明还提供了体外分化获取的类角膜内皮细胞的鉴定指标。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

类角膜内皮细胞的获取方法，步骤如下：

(1)拟胚体的获取：将人类胚胎干细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞上，用胶原酶Ⅳ和DispaseII铺满培养器皿进行消化后，采用无血清培养基培养，以获取拟胚体；

(2)预分化培养：将步骤(1)获取的拟胚体采用补充了头蛋白和TGF-β1受体抑制剂的分化培养基A中培养4～5天或分化培养基B中培养12～16天，即获得预分化培养中间细胞；

(3)分化培养：将步骤(2)预分化培养后中间细胞转移至包被了硫酸软骨素和层粘连蛋白的培养器皿中，采用分化培养基C培养7～8天或采用分化培养基D培养25～40天，即获得类角膜内皮细胞。

步骤(1)中所述的胶原酶Ⅳ和中性蛋白酶DispaseII的配比是1：1～5，其中配置前，胶原酶Ⅳ的浓度为400-1000U/mL，中性蛋白酶DispaseII的浓度为1～6U/mL；

无血清培养基：基础培养基为DMEM/F12培养基，并添加了10％～20％的血清替代物，10～20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培养基及添加剂，100单位/mL的青-链双抗，0.1mM的β-巯基乙醇；

所述的步骤(2)中补充头蛋白后的浓度是300～1000ng/mL；补充TGF-β1受体抑制剂后的浓度是2.5～15μM。