[发明专利]局部微环境改变对外周神经损伤修复影响的实验研究

说明书

技术领域

本专利涉及局部微环境（免疫学）改变对外周神经损伤修复影响的实验研究。

背景技术

周围神经损伤后，远侧段全程及近侧段局部轴突及髓鞘发生变性、崩解，引起大量炎性细胞聚集，产生多种细胞因子，这些细胞因子参与到周围神经损伤修复再生的各个阶段，对神经再生的质量及速度有着重要作用。

髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是存在于中枢神经系统髓质内的主要蛋白，是引起中枢神经系统炎症的主要自身抗原，转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）TGF-β是一种极强的免疫调节剂，能抑制多种免疫反应，对单核巨噬细胞等炎性细胞具有极强的趋化性。

轴突生长抑制因子(Nogo)抑制轴突生长的特性更是广为人知，但实际上，适当的Nogo蛋白的存在，却起到确保神经生长准确性的作用 。

外周神经损伤后，损伤局部区域出现的免疫反应能否得到有效控制从而更有利于神经再生，目前尚未有明确结论。

本研究即是针对上述问题，通过动物实验，探究外周神经损伤后，“血-神经屏障”破坏，局部免疫环境改变情况下，影响外周神经损伤修复的分子生物学机制，为临床上制定更有特异性和有效的治疗方案提供依据 。

发明内容

TGF-β在正常组组织细胞表达弱阳性；在对照组及实验组，TGF-β均有明显表达，但随时间推移逐渐降低，NOGO-a在正常组及对照组组织细胞中几乎无表达；实验组坐骨神经内NOGO-a阳性表达，1周<2周>4周。

神经损伤后髓磷脂碱性蛋白（MBP）与多肽转化生长因子（TGF-β）同时促进神经修复，而轴突生长抑制因子（NOGO-a）高表达稍滞后，在于保证神经修复生长的准确性。

实验证实，MBP在正常组及对照组组织细胞中都有表达，但在实验组MBP呈现较强的表达，说明在外周神经损伤、“血-神经屏障”破坏，局部区域内免疫环境发生改变的过程中，有MBP的原因存在TGF-β通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能。

实验中观察，外周神经损伤发生后，TGF-β具有明显的表达，其意义可能是多方面的。

一方面TGF-β可发挥其本身特有的生物学效应，直接参与细胞的增殖分化、代谢和内外间质的形成，促进组织修复，另一方面，作为一种极强的免疫调节剂，TGF-β还可能抑制在外周神经损伤、“血-神经屏障”破坏，由MBP等引发的局部区域内免疫环境的改变，从而更有利于神经修复。轴突生长抑制因子(Nogo)抑制轴突生长的特性更是广为人知，但实际上，适当的Nogo蛋白的存在，却有利于神经纤维正常生长。

实验中观察，外周神经损伤发生后，损伤部位出现Nogo-a的高表达，但其表达的峰值稍滞后，说明Nogo-a的高表达的意义，可能在于确保神经再生的准确性。

具体实施方式

4只Wistar大鼠随机分为实验组(n=20)，假手术组(n=20)和正常对照组(n=4)实验组横断右侧坐骨神经后，行神经外膜端端吻合。

假手术组仅游离出坐骨神经，然后关闭切口；正常对照组不做任何处理。

于术后1,2,4周时取术侧坐骨神经， H-E染色并采用SABC免疫组化方法检测坐骨神经内髓磷脂碱性蛋白（MBP）、轴突生长抑制因子（NOGO-a）、多肽转化生长因子（TGF-β）的表达，并对染色结果进行统计学分析。

实验试剂，多聚赖氨酸、S-P法免疫组化试剂盒、MBP鼠单克隆抗体、TGF-β鼠单克隆抗体、Nogo-a鼠单克隆抗体、DAB显色剂。

实验方法：HE 染色、MBP免疫组化染色 、TGF-β免疫组化染色 、Nogo-a免疫组化染色。

统计学分析，使用OLYMPAS BX-50多功能显微镜观察并照相。运用显微图像分析系统（Simple PCI）测定组织内反应产物的平均光密度值，结果用x±s表示，并对所得数据利用SPSS10.0统计学软件进行Q检验。

结果，MBP免疫组化染色，MBP在正常组及对照组组织细胞中即有明显表达；在实验组MBP则呈现较强的表达；但经统计学分析(Q检验)，组内比较差异无统计学意义。

不同时间点实验组MBP免疫组化染色，经统计学分析(Q检验)，组内比较差异无统计学意义。