[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌工程菌高产D-核糖的方法

说明书

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌工程菌高产D‑核糖的方法。本发明基于D‑核糖生产菌株SFR‑4和菌株SFA‑H43基因组的高度同源性，采用同源重组的方法将菌株SFR‑4转酮酶基因突变序列转入野生菌株SFA‑43中，替换该菌株转酮酶基因，获得一株转酮酶变异序列的工程菌株SFR‑43T；工程菌株SFR‑43T既保持了菌株SFA‑43的优良发酵性能(抗逆性好、耗糖速度快)，同时可以积累D‑核糖。通过控制初始糖浓度和发酵过程流加葡萄糖酸内酯工艺，可以大幅提高工程菌株D‑核糖产率和转化率，控制3‑羟基丁酮的积累。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种及工业品的微生物发酵制备，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌工程菌高产D-核糖的方法。

背景技术

D-核糖是一种五碳糖，是生命遗传物质核糖核酸以及生理活性物质ATP、NADH、NADPH、FADH的重要组成部分，是生物体内能量代谢的主要参与者，具有重要的生理功能。

D-核糖在工业中主要用于核黄素维生素B₂以及食品鲜味剂的生产，近年来，更多的研究已将D-核糖可作为医药中间体，用于抗病毒、抗肿瘤药物的合成，另外，D-核糖还可以作为辅助药物用于治疗心肌局部缺血、过度劳损引起的肌肉僵硬、肌肉酸痛等病症。

D-核糖的生产方法包括从酵母核酸中提取、化学合成法以及利用微生物菌株发酵转化。提取法和化学合成生产D-核糖因为生产效率低、工艺复杂等诸多原因始终没有形成规模化生产。微生物发酵法生产D-核糖生产效率高、工艺简便、生产成本低，使D-核糖价格大幅度下降，真正实现了D-核糖规模化生产。

D-核糖生产菌株多是通过传统诱变筛选转酮酶缺陷型突变株。1970年Sasajima等人发现一株枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株积累D-核糖，产量达35g/L，并且发现一株转酮酶缺失回复突变株不再积累D-核糖，证明D-核糖积累是由于转酮酶缺失造成的(SasajimaK et al.Agric Biol Chem,35(4),509-517,1971)。对于D-核糖的发酵生产，开发出发酵性能优良、产率高的工程菌株仍是本领域技术人员面临的主要问题。

发明内容

发明人前期通过传统诱变的手段选育获得一株转酮酶缺失突变株SFR-4，经条件优化后该菌株D-核糖产率可达到62.3g/L(赵祥颖等,食品与药品,7(3):23-26,2005)，然而发明人进一步研究发现由于随机诱变产生的负突变积累，菌株SFR-4环境耐受性较差，生长缓慢，在工业生产过程中存在较大的染菌风险，这成为限制该菌株D-核糖发酵效率提升、成本下降的一个重要原因。

针对现有技术存在的上述问题，尤其是针对菌株SFR-4环境耐受性较差、生长缓慢、在工业生产过程中存在较大的染菌风险的问题，本发明提供一株抗逆 性强、生长旺盛、不易染菌的D-核糖发酵的枯草芽孢杆菌工程菌，本发明基于现有传统诱变选育获得转酮酶缺陷型D-核糖高产枯草芽孢杆菌抗逆性差的问题，通过分子生物学手段获得一株具有抗逆性好、耗糖速度快D-核糖生产菌株，进一步的，通过发酵工艺控制和代谢调控条件改变，调控菌株自身的代谢流向，使得该菌株更倾向于发酵生产D-核糖，可显著提高D-核糖的产量和产率。

发明人将菌株SFR-4进行了全基因组测序，针对测序结果，发明人偶然发现菌株SFR-4与另一株发明人分离的积累3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株SFA-H43(赵祥颖等，一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用，中国专利CN 103333842A，保藏号CCTCC No:M2013181)基因组功能基因组成高度相似，而与枯草芽孢杆常用168菌株比较差异相对较大(见附图1)。