[发明专利]一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法

说明书

本发明公开了一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法操作如下：步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；步骤(2)将处理好的DRG采用DRG‑SGCs培养液培养，诱导大量的卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；步骤(3)离心后弃上清液，然后加入培养液继续培养，得到卫星胶质细胞。本发明培养和纯化的卫星胶质细胞体外可存活较长时间，纯度高，稳定存活，可传代多代，形成细胞网络。

技术领域

本发明属于背根节卫星胶质细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种体外原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法。

背景技术

背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)的神经细胞是躯体感觉的初级传入神经元，其中枢突进入脊髓发出上行纤维，与其它部位的神经元再次形成突触连接，如和丘脑的神经元形成脊髓丘脑束等。这些神经元和上行纤维在感觉从外周到中枢的传递过程中起着重要的作用。卫星胶质细胞(satellite glial cels，SGCs)是外周神经中一种重要的神经胶质细胞，它们广泛地分布于背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)和三叉神经节(trigeminal ganglia，TG)内.卫星胶质细胞包绕1-2个神经元形成胶质细胞鞘，在两个相邻的卫星胶质细胞之间存在着缝隙连接，通过缝隙连接可以实现胶质细胞之间的交流。DRG-SGC的培养为研究神经系统发育过程中突起的生长发育机制和影响因素、神经元如何形成特殊的突触联系、如何构成极其复杂的神经网络以执行各种生理功能等这些问题提供了良好的模型。因此，建立一种稳定的、高效的、高纯度的DRG-SGCs体外原代培养模型具有重要意义。

目前国内研究多集中于从DRG中体外分离培养神经元，常用的方法是取大鼠脊髓背根神经节，用酶消化后制成单细胞悬液，建立体外背根神经节单细胞培养体系。例如禹晓东等人在“大鼠脊髓背根神经节神经元的纯化培养”一文中取新生SD大鼠的脊髓背根神经节，采用胰蛋白酶消化法，制成单细胞悬液，加入阿糖胞苷以纯化细胞，培养于含10％胎牛血清与重组人胶质细胞源性神经营养因子的DF12培养基中，观察神经元生长状况。李全波等人在“大鼠背根神经节神经元细胞纯化培养的模型建立”以及谭洪毅等人在“体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养”中通过胰蛋白酶+EDTA消化DRG、交替使用DF-12培养基和加有阿糖胞苷抗有丝分裂的DF-12培养基培养等方法，在体外获得纯化的背根神经节神经元。张军等人在“胚胎大鼠背根神经节神经元的培养与纯化”，以及隋峰等人在“一种原代培养大鼠DRG神经元的新方法”中把DRG置于0.25％胰蛋白酶液中消化20min(37摄氏度)，加入胎牛血清(FBS)终止消化，然后在DMEM中制成单细胞悬液，经差速贴壁50min去除成纤维细胞，获得大鼠背根神经节单细胞培养体。上述方法只能从DRG中体外分离培养神经元，但未能分离培养卫星胶质细胞。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法采用鼠的DRG组织，不需要经过消化过程，直接培养卫星胶质细胞，操作简单，可获得大量高度纯化和稳定的背根节卫星胶质细胞，可作为发育神经生物学、神经生物学和临床神经病学等研究的重要模型。

本发明的技术方案如下：一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法操作如下：

步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；

步骤(2)将处理好的DRG采用DRG-SGCs培养液培养，诱导大量的卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后进行细胞传代，加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；