[发明专利]体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明涉及体外定量测定vWF‑CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法；方法包括试纸条制备、反应液制备、显色反应、酶活性计算等步骤，检测试剂盒包括试纸条、标准品1、标准品2、vWF‑CP底物、工作液和终止液，试纸条上的金标抗体为胶体金标记的抗vWF‑CP底物抗体，T线抗体为抗vWF‑CP底物抗体，C线抗体为抗金标抗体抗体，金标抗体与T线抗体结合vWF‑CP底物上不同的位点；标准品1和标准品2分别为高vWF‑CP酶相对活性和低vWF‑CP酶相对活性的制品；工作液为含二价金属离子的缓冲液，终止液为含能络合二价金属离子的缓冲液；检测试剂盒的制备方法包括试纸条制备、标准品制备、vWF‑CP底物制备、工作液和终止液制备等步骤；本发明的方法、检测试剂盒，检测快捷、灵敏度高、准确性好。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法。

背景技术

血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)是一种严重的弥散性血栓性微血管病，以微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少，以及微血栓形成造成器官损害(如肾脏、中枢神经系统等)为特征。早期报道，TTP发病率为0.2～1/10万，随着临床上对于此疾病的逐渐认知，近年来TTP的发病率有上升的趋势。目前，国内尚未见到相关的流行病学统计。病人以女性为多，任何年龄均可发病，但最常见的发病年龄多为20～60岁，没有地域或种族的差异。在临床中具备典型“五联征”(微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少、微血栓形成造成器官损害、神经系统异常和发热)的患者，常因其表现的多样性和非典型而导致误诊，TTP早期明确诊断并及时治疗，病死率可从90％降为20％～30％，整体生存率提高为70％～85％。目前，血浆置换是TTP首选和有效的治疗方法，并且发病后越早治疗救活率越好。同时因为血浆置换的治疗费用昂贵，血制品稀缺，并且有感染病毒性疾病和引起并发症的风险，一旦误诊后果严重。因此是否能够早期迅速诊断及应用血浆置换治疗是影响TTP预后的重要因素。因此，TTP的早期发现至关重要。

目前对TTP的诊断主要依靠临床表现，尚无特异的诊断性实验室检查，缺乏客观性与可靠性。研究发现，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一种大分子多聚体糖蛋白，在止血和血栓形成中起着重要作用。vWF多聚体的结构组成主要受血管性血友病因子裂解酶(von Willebrand factor cleaving protease,vWF-CP)调节，vWF-CP又名为ADAMTS-13(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin 13repeatsfamily of metalloproteases)，正常人血浆中存在能够裂解uL-vWF('unusually large'vWF)的蛋白酶。该酶在正常机体内可以特异性地裂解vWF的A2区的第1605位酪氨酸—1606位蛋氨酸(Y1605-M1606)之间的肽，从而使vWF裂解，保持正常的止血和血循环功能。当体内vWF-CP基因缺陷或者血浆中产生针对该酶的自身抗体时，vWF-CP的活性下降，uL-vWF在微血管中诱发血小板聚集形成微血栓，导致TTP的发生。临床研究发现，正常人vWF-CP的活性水平下限大多大于正常人平均值的50％，上限因测量方法不同而有所区别。遗传性TTP患者，其活性都低于正常活性的5％～10％，甚至几乎为零。获得性TTP患者大部分也有重度降低，仅少数患者只是轻度和中度下降。

判断vWF-CP酶活性水平，对此类疾病的诊断和预后判断具有重要价值。早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子(vWF)，底物为全片段长vWF，多聚物，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，16-48小时左右，时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。