[发明专利]一种氧化还原敏感型VEGF‑siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程的技术领域，尤其是涉及一种氧化还原敏感型VEGF-siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒及其制备。

背景技术

VEGF-siRNA是血管内皮生长因子siRNA，siRNA(silencing RNA)是一种能使相应的基因表达沉默的核糖核酸。自从siRNA被发现以来，研究者们致力于通过siRNA沉默某些致病基因，达到基因治疗的目的，尤其在治疗肿瘤和治愈感染。siRNA在疾病的预防上有巨大的发展前景，但是无修饰的siRNA稳定性差，其憎水性导致细胞摄取能力差，并且极易被核糖核酸酶降解，在体内循环的半衰期非常短暂(例如短至几分钟)。因此，要将siRNA成功的应用到临床，需要开发安全、有效、低毒、高靶向的siRNA递送系统。

目前，常用的siRNA载体包括病毒、脂质体、阳离子聚合物纳米颗粒、胞内体、石墨烯等。这些载体，在活体治疗方面取得了一定的成功，但是也需要不断的改进。例如，病毒具有靶向专一性和高的转染效率，但是随之而来的风险是具有免疫原性和回复病毒的毒性。

蛋白作为人体必须的营养物质，生物相容性好，而蛋白纳米颗粒作为一种负电性的颗粒，可以在体内有效循环，若能将其与siRNA复合，则可以将siRNA有效递送到肿瘤部位，因此蛋白有望被开发成一种新型、有效的siRNA递送系统。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种氧化还原敏感型VEGF-siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒及其制备。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种氧化还原敏感型VEGF-siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒，包括通过双硫键连接的VEGF-siRNA和鸡卵清蛋白，其中，VEGF-siRNA和鸡卵清蛋白的质量比为10～100:1。

作为上述方案的优选，其粒径为50～300nm。

作为上述方案的优选，所述的VEGF-siRNA为双链RNA，其中一条链的核苷酸序列为如序列表1所示，具体为5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3'，另一条链的核苷酸序列如序列表2所示，具体为5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'。

作为上述优选方案的更优选，所述的VEGF-siRNA经巯基化修饰，再还原后，即带有所述双硫键。

作为上述更优选方案的进一步优选，所述的VEGF-siRNA的巯基化修饰位置为5'。

氧化还原敏感型VEGF-siRNA/鸡卵清蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)取处于氧化态的经巯基化修饰的VEGF-siRNA，，还原后，配成氧化还原VEGF-siRNA溶液；

(2)取步骤(1)中配成的VEGF-siRNA溶液与鸡卵清蛋白混合，热聚反应，即得到目的产物。

作为上述方案的优选，步骤(1)中处于氧化态的巯基化修饰的VEGF-siRNA采用常规的巯基还原过程，其具体过程为：

(a)取TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐，Tris(2-carboxyethy)phosphine hydrochloride，简称TCEP)溶液作为还原剂，与巯基化修饰的VEGF-siRNA混合，，涡旋20-120分钟，使巯基充分氧化成双硫键，再依次加入醋酸钠溶液溶解，-20℃静置10-60分钟，最后加入不良溶剂无水乙醇沉淀VEGF-siRNA，经离心分离得到还原态的巯基化VEGF-siRNA；

(b)将除去无水乙醇的VEGF-siRNA干燥后，加入无酶水，即配成所述氧化还原VEGF-siRNA溶液。

作为上述优选方案的更优选，步骤(a)中TCEP溶液的浓度为0.1M，醋酸钠溶液的浓度为3M，加入的TCEP溶液、巯基化修饰的VEGF-siRNA、醋酸钠和无水乙醇的比例为(50-1000)μL：1OD：(10-200)μL：(0.5-5)mL；

静置温度为-20℃，时间为20min；

步骤(2)中所述的鸡卵清蛋白溶液采用无酶水配制而成，其浓度为0.5mg/L。

作为上述方案的优选，步骤(2)中热聚反应的温度为50-90℃，反应时间为0.5-20分钟。

作为上述方案的优选，在进行热聚反应时，还需加入pH范围为5.5-6.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液。