[发明专利]B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法

说明书

本发明公开了一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，属于重组人胰岛素及其类似物晶体的制备领域。本发明B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、柠檬酸三钠、无机盐和锌离子，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。本发明试验发现，结晶液中柠檬酸三钠浓度、锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比以及有机溶剂浓度等对晶体的形态、大小以及收率等具有重要影响。本发明通过对结晶条件进行优化，使制备的B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体形状规则、大小均一，而且结晶的收率和纯度高，利于后续的修饰和纯化工艺。

技术领域

本发明涉及胰岛素类似物（或人胰岛素前体）晶体的制备方法，尤其涉及一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素（desB30）晶体的制备方法，属于重组人胰岛素及其类似物晶体的制备领域。

背景技术

近年来随着人们生活水平的提升，糖尿病患者数量也持续增加。胰岛素制品是公认的最有效的糖尿病治疗手段之一。随着科学技术的发展，从提取动物胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。

去除B30位苏氨酸的胰岛素（desB30）是通过重组微生物发酵得到胰岛素前体经纯化、酶切后得到的重要中间体，后续通过不同的修饰反应和纯化后可制备得到地特胰岛素、德谷胰岛素或其它胰岛素类似物。

地特胰岛素是一种中性、可溶的长效胰岛素，它是原型胰岛素去除了B链第30为苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，具有药效长并可减少低血糖的出现等优点。

德谷胰岛素是新一代可溶性、超长效基础胰岛素类似物，其分子保留了绝大部分的人胰岛素氨基酸序列，仅是去掉人胰岛素B链30位的苏氨酸，并通过谷氨酸连接子将一个十六碳脂肪二酸侧链连接到B29位赖氨酸上，具有药效长，低血糖发生率低的特点。

虽然desB30样品经过胰岛素前体发酵液微孔过滤、初级纯化、酶切和等电点沉淀，但由于发酵产物的成分相对复杂，酶切得到的desB30纯度约在80%左右，还是有很多可见和不可见的色素或其它蛋白或核酸等，影响后续工艺的开发，同时易造成对纯化介质的污染，影响其使用次数。除此之外，直接等电点沉淀的desB30还存在不稳定、易降解或脱氨等缺点，因此需要增加一步工艺去除这些杂质，提高澄清度和纯度以及储存稳定性。

通过对desB30样品进行结晶工艺研究，获得晶型相对均一的晶体，desB30以固态晶体形式存在，样品更稳定，更易贮存。另外desB30晶体的纯度高，有利于后续修饰反应的开展。因此，进行desB30的结晶工艺研究具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素（desB30）晶体的制备方法，该方法操作简单，结晶的收率高，所制备的desB30晶体形状规则、大小均一，而且纯度高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，包括以下步骤：（1）将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠和无机盐，得到结晶液；（2）调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。

其中，步骤（1）所述结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.01-0.1 M，优选为0.01-0.05M，更优选为0.025-0.05 M，最优选为0.04-0.05 M。

步骤（1）所述结晶液中锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比为7-20：1，优选为10-15：1，更优选为10-12：1，最优选为10-11：1。所述锌离子来自于常见的锌源，优选的，所述锌离子来自于氯化锌、醋酸锌或碘化锌中的任意一种，优选为氯化锌或醋酸锌中的任意一种。