[发明专利]黄野螟酪氨酸羟化酶全长序列及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及到黄野螟酪氨酸羟化酶基因全序列及其克隆方法。该基因编码酪氨酸羟化酶，该酶是研究黑色素水平调控的重要材料，具有重要的害虫防治意义。

技术背景

酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)以酪氨酸为底物能够在四氢生物喋呤 (tetrahydrobiopterin，)作为辅因子存在的条件下催化酪氨酸形成多巴，然后在多巴脱羧酶(dopadecarboxylase，DDC)的作用下使多巴转化成多巴胺，继而在一系列酚氧化酶和辅因子的作用下形成黑色素。已有的研究表明，黑色素是昆虫斑纹和体色形成的重要色素源，而昆虫斑纹和体色对于昆虫适应环境、预防天敌及后代繁殖等起着重要作用。作为黑色素合成的关键酶，酪氨酸羟化酶对昆虫是十分重要的酶。该基因除了控制昆虫体内黑色素的形成外，还是外骨骼硬化及变态发育的关键基因，对昆虫的正常发育起重要作用。

黄野螟(Heortia vitessoides)属鳞翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，在我国广泛分布于广东、广西、海南和云南等南方各省以及香港特别行政区。黄野螟是典型的寡食性害虫，仅取食沉香属(Aquilaria)和漆树属(Rhus)等少数几种植物近年来，随着海南、广东和云南等地人工大规模种植白木香面积的日益扩大，黄野螟的危害也越来越严重。据广东化州地区统计，黄野螟发生严重时，白木香的被害株率可高达90％以上。有关黄野螟酪氨酸羟化酶基因目前无人研究，本发明填补了这一空白，对深入研究黄野螟黑色素水平调控及黄野螟防止新方法奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供黄野螟酪氨酸羟化酶基因全序列及其克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

1、黄野螟总RNA的提取

将外地采集的黄野螟活成虫经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的 EP管中，并置于-70℃低温冰箱内保存备用。采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II总RNA提取试剂盒(OMEGA)来提取黄野螟的总RNA。

2、引物设计和3′RACE扩增

在本实验室构建的cDNA文库中，查找并获得了黄野螟酪氨酸羟化酶基因的全序列 5′端序列，本发明是在此基础之上进行3′RACE扩增，目的在于获得黄野螟酪氨酸羟化酶基因全序列。

3′RACE扩增的特异性引物为：

HV-TH-3′-Outer：TGCGTGACGGTATGGGAT；

HV-TH-3′-Inner：ACGCCAACTCTCCATTCC。

3、目的基因克隆及测序

获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收相应目的DNA片段，同pMD20-T 载体进行连接，将连接后的产物转化到E.coli DH5α感受态细胞之中，然后进行AMP抗性蓝白斑的筛选，挑取合适的阳性菌落进行质粒提取。最后经由菌落PCR鉴定后进行测序。

4、序列拼接

将测序正确的序列与实验室已构建的黄野螟cDNA文库中的酪氨酸羟化酶基因序列进行不重复拼接，从而获得黄野螟酪氨酸羟化酶基因全长序列。

黄野螟酪氨酸羟化酶基因全长序列，此序列如下：

此序列中划线处标示的atg为初始密码子，划线处标示的tga为终止密码子。

根据黄野螟酪氨酸羟化酶基因ORF(Open reading frame)全序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：

本发明获得了黄野螟酪氨酸羟化酶基因全序列，通过对黄野螟成虫的预处理、总 RNA的提取、3′RACE扩增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黄野螟酪氨酸羟化酶基因全长序列，该序列全长2220bp，ORF序列全长1677bp，ORF序列共编码558个氨基酸。

具体实施方式

以下实施例将本发明进一步说明。

1、黄野螟总RNA提取

黄野螟成虫采自广州市华南农业大学启林区土沉香林。经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的EP管中，并置于-70℃低温冰箱内保存备用。