[发明专利]一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法

权利要求书

1.一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取传染性法氏囊病病毒接种15～30日龄SPF鸡，72～96小时后剖检取出法氏囊组织，研磨，对研磨液进行10^-1～10^-3倍稀释；

2)以步骤1)所得产物作为步骤1)所述传染性法氏囊病病毒，再重复步骤1)2～4次，得到病毒组织液；

3)取以9～11日龄的SPF鸡胚所制备的CEF细胞，以2×10⁶～3.0×10⁶细胞量/mL的接种量接种至含有5～10％(v/v)胎牛血清的M199培养基中培养过夜；

4)取步骤2)所得的病毒组织液稀释10^-2～10^-3倍后接种于步骤3)所得产物中，培养48～72小时后收获病毒液；

5)以步骤4)所得产物作为步骤4)所述病毒组织液，再重复步骤4)1～2次，得到CEF驯化种毒；

6)对步骤5)所述CEF驯化种毒进行蚀斑纯化，驯化过程包括：

A)取步骤5)所述CEF驯化种毒，进行梯度稀释后分别接种于铺满DF-1细胞单层的细胞培养板，于35～40℃吸附1h，弃去病毒液，加入含琼脂糖的病毒维持液，35～40℃条件下倒置培养72～96小时，挑取稀释倍数最大孔的蚀斑，将其溶于不含血清的病毒培养液，即得到蚀斑病毒；

B)以所述蚀斑病毒作为步骤A)所述CEF驯化种毒，再重复步骤A)2～4次，收获病毒。

2.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤1)中接种前先对传染性法氏囊病病毒进行10^-1～10^-3倍稀释，而后再接种。

3.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤3)中所述培养及步骤4)中所述培养，均是在37℃下进行的。

4.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤4)中接种前，步骤3)所得产物的CEF细胞已长满培养基单层。

5.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)所述梯度稀释的稀释倍数分别为：10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍。

6.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)中DF-1细胞是利用以下成分的培养基培养的：含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。

7.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6A)中所述病毒维持液是含有2％胎牛血清的DMEM/F12培养基。

8.根据权利要求1所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤6)完成后继续执行以下步骤7)：

M)以步骤6)所得产物为种毒，进行10^-2～10^-3倍稀释后接种于长满单层的DF-1细胞，37℃培养下培养18～30小时，收获病毒液，检测TCID₅₀；

N)步骤M)收获的病毒液作为步骤M)所述种毒，再重复步骤M)5～9次。

9.根据权利要求8所述的一种提高传染性法氏囊病病毒效价稳定性的方法，其特征在于步骤M)所述检测TCID₅₀具体包括以下操作：消化DF-1细胞并计数，以2×10⁵细胞量/mL的密度加入到96孔细胞板，100μL/孔，37℃培养20～28小时，将待测病毒做10倍系列稀释，弃去细胞液，加入10^-6、10^-7、10^-8稀释度病毒液，37℃条件下培养96小时，按100％细胞病变判定效价。