[发明专利]一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，进步涉及DNA疫苗研发技术，具体涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用。

背景技术

Ⅰ群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。FAV-4具有明显的致病年龄段，对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播。1987年在巴基斯坦临近卡拉奇的安哥拉首先报道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的几个邦、厄瓜多尔、秘鲁、智利、中南美洲、俄罗斯和孟加拉国等国相继发现该病。如今，世界各地都有HHS的踪影，遍及拉丁美洲、中东和亚洲的一些国家。

通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国内尚无疫苗可用，导致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。

目前，FAV-4接种鸡胚或原代鸡肾脏细胞肝细胞来接种制备疫苗。鸡胚繁殖病毒毒价低，病毒需要高倍浓缩，成本高昂；而原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作。所以急需新型的疫苗。DNA疫苗的出现，开拓了FAV疫苗研究的新方法。DNA疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，对不同血清亚型毒株具有交叉保护，还具有嵌合免疫、多重免疫及联合免疫等优点。

Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形态，毒粒直径为70-90nm，无囊膜，呈球形，二十面体对称结构。病毒粒子具有252个壳粒，240个非顶角壳粒为六邻体，12个顶角壳粒为五邻体，每个五邻体有2条纤维突起。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，以解决现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对Ⅰ群4型禽腺病毒免疫效果不佳的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中抗原物质的免疫原性较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对疾病的防疫范围较为局限。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。

作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是在其天然表达基因基础上以鸡偏嗜密码子替换其中的鸡稀有密码子所得的产物。

作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。

作为优选，所述抗原是通过以下方法制备的：

1)分别以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；

2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQ ID No.2所示状态，合成该基因到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-optiFAV4C；

3)将重组载体pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoR I和Sma I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜，将连接产物在宿主细胞中扩增。

作为优选，所述将连接产物在宿主细胞中扩增，具体包括以下操作：将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，即得到作为抗原的质粒pCAGoptiFAV4C。