[发明专利]一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种新城疫病毒样颗粒，其特征在于，由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒在制备预防禽新城疫病毒感染灭活疫苗药剂中的应用。

3.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）人工合成各结构蛋白基因序列，即分别人工合成SEQ ID NO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的碱基序列；

（2）构建表达新城疫病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为，

将步骤（1）中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分别克隆至转移载体pFastBac1中，获得重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1；

将重组质粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分别转化Escherichia coli DH10 Bac 感受态细胞，筛选获得重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1；

利用脂质体介导转染法，将重组杆粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分别转染宿主Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

（3）新城疫病毒样颗粒的制备和纯化，具体为，

将重组杆状病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接种感染宿主Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的病毒样颗粒会分泌到细胞培养上清中，经离心去除细胞碎片，切向流浓缩，再经分子筛过滤和阴离子交换层析后得到纯化的病毒样颗粒；

重组杆状病毒共接种感染宿主Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV-M1：rBV-F1：rBV-NP1：rBV-HN1=3:2:1:2；

切向流浓缩操作时，采用50kDa分子量截留的切向流浓缩管在3500r/min水平离心15分钟。

4.如权利要求3所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，提纯操作时，采用不连续的20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心方法，替代分子筛过滤和阴离子交换层析操作。