[发明专利]一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用

说明书

本发明属于新城疫疫苗技术领域，具体涉及一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用的专利申请。该病毒样颗粒由新城疫病毒M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中M蛋白对应的M1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白对应的F1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白对应的NP1基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白对应的HN1基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。本发明具有结构蛋白表达水平高、病毒样颗粒自行组装，免疫原性与真实病毒粒子更为接近、病毒样颗粒的产量和纯度高、免疫效果好等技术优势。

技术领域

本发明属于新城疫疫苗技术领域，具体涉及一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用的专利申请。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，被OIE列为必报动物疫病，也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒学分类中属于副黏病毒科、禽副黏病毒属的一个种，即禽副黏病毒1型，是一种不分节段的单分子负链RNA病毒。

新城疫病毒基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒颗粒为有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直径约为120nm~300nm，囊膜表面覆盖有8nm长的纤突，病毒粒子内部为一直径17nm左右的卷曲核衣壳。基质蛋白M位于囊膜和核衣壳之间，既与膜结合又与核衣壳结合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驱动力。

病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过与病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。

病毒样颗粒的制备可基于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及昆虫杆状病毒这四种表达系统，而利用昆虫杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒种类已占到了30%以上，其主要原因在于该系统具有不同于其他表达系统的独特优点：（1）承载量大：杆状病毒可容纳较大的外源DNA插入(约l0kb)而不影响病毒的复制与装配；(2)高效表达：多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，外源基因表达量往往是其他系统的几十到几百倍；(3)表达产物后加工较完善：昆虫细胞对蛋白质的后加工系统与哺乳动物细胞接近，具有表达产物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信号肤和形成三级或四级高级结构的特点，所以在结构、生物活性、抗原性和免疫性等方面与天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达两个或多个外源蛋白，便于研究肽链的装配和蛋白寡聚体的结构和功能；(5)适合表达细胞毒性蛋白：应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使表达产物是细胞毒性蛋白，也不影响表达水平，因为在这些有毒产物表达之前，病毒已经完成复制并释放出大量成熟的子代毒粒，不会干扰病毒的复制；(6)安全性好，杆状病毒是昆虫或者节肢动物病毒，对人畜无害，外源基因插入多角体蛋白基因位点引起其缺失或失活，因此重组病毒不能产生包涵体，这不仅为重组病毒提供了选择标记，而且重组病毒无多角体蛋白形成，失去了病毒粒子的天然防护物一多角体蛋白结晶体，极易在自然环境中失活，不能像野生病毒那样在环境中长期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)杆状病毒表达载体通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。因此，用该系统生产病毒样颗粒容易形成产业化。