[发明专利]一种I型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂

权利要求书

1.一种基于I型神经纤维瘤病致病基因突变的病因学诊断试剂，其特征在于，所述突变位于NF1基因第48号外显子区域，其编码第7106位的鸟嘌呤替换为腺嘌呤从而引起第2369位的色氨酸突变为终止密码子(c.7106G>A，p.W2369X)；所述诊断试剂包括点突变分析试剂盒，所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血总RNA提取；2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒；3)cDNA测序体系试剂盒；所述cDNA测序体系试剂盒：对反转录获得的cDNA以SEQ ID NO.7-16所示五个引物对进行PCR扩增，再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQ ID NO.17-60所示引物对同时进行巢式PCR扩增和测序，并与原NF1基因编码DNA序列比对，当扩增产物中c.7106G>A，p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。

2.按照权利要求1所述的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂还包括NF1基因外显子缺失分析试剂盒：以所述反转录获得的NF1基因cDNA为模板，以SEQ ID NO.61-70所示引物对分别对NF1的外显子3、11、25、34、58进行实时荧光定量PCR扩增，以2^-ΔΔCt法进行数据分析，计算得到五个外显子的相对基因含量，当五个外显子的相对基因含量均在0.5左右时为外显子缺失携带者。

3.按照权利要求2所述病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂还包括NF1全基因大片段缺失分析试剂盒，所述试剂盒包括1)DNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血基因组DNA提取；2)基因内微卫星多态标志分析试剂盒：以所述基因组DNA为模板，以SEQ IDNO.1-6所示的三对引物对27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三个多态性位点进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，当PCR产物中三个引物对扩增的片段均为纯合子时NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。

4.按照权利要求1所述的病因学诊断试剂，其特征在于，所述对cDNA进行PCR扩增获得五个大片段时，引物退火温度为60℃；对五个大片段进行巢式PCR扩增时，引物退火温度为62℃。

5.按照权利要求2所述的病因学诊断试剂，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增合成引物片段不超过350bp。

6.按照权利要求3所述的病因学诊断试剂，其特征在于，所述27CAGT扩增片段的大小为201bp左右，27AC28.4扩增片段的大小为214bp左右，38TG53.0扩增片段的大小为479bp左右。

7.按照权利要求3所述病因学诊断试剂中用于检测NF1基因突变的引物对组，其特征在于，包括用于检测NF1基因大片段缺失的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6所示；用于扩增cDNA获得五个大片段的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示；用于对cDNA的五个大片段进行巢式PCR扩增的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示；用于检测NF1基因外显子缺失的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.61-70所示。

8.按照权利要求1、2或3所述病因学诊断试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述引物对组中的70条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。