[发明专利]一种I型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂

说明书

本发明涉及一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂。本发明提供的神经纤维瘤病因学诊断试剂包括点突变分析试剂盒，所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血总RNA提取；2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒；3)cDNA测序体系试剂盒；所述cDNA测序体系试剂盒：对反转录获得的cDNA以SEQ ID NO.7‑16所示五个引物对进行PCR扩增，再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQ ID NO.17‑60所示引物对同时进行巢式PCR扩增和测序，并与原NF1基因编码DNA序列比对，当扩增产物中c.7106G>A，p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。本发明的病因学诊断试剂省时、准确、且检测成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因检测领域，尤其涉及一种I型神经纤维瘤病致病突变基 因及基于此突变基因的病因学诊断试剂。

背景技术

I型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type I,NF1)由von Recklinghausen于1882年首 次报道，故又称为von Recklinghausen病。I型神经纤维瘤病一般为常染色体显性遗传，部 分为散发。临床上主要表现为皮肤咖啡斑、多发性皮肤软纤维瘤；非暴露部位(如腋窝、 腹股沟)出现的雀斑和虹膜黑色素错构瘤；也可累及多个器官和系统，如眼、骨骼、血管、 内分泌系统、中枢及外周神经系统等，并可伴有智力发育障碍、先天性发育不良、极罕见 恶变者。

该病由NF1基因发生突变引起。NF1基因定位于染色体17q11.2，包含57个组成性外显子和3个可变剪接外显子，全长283kb，有3个大小为11～13kb的成熟转录本，编码 相对分子质量为327000、由2818个氨基酸组成的神经纤维(Neurofibromin)蛋白，大量表 达于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肾上腺细胞、性腺细胞和白细胞。NF1基 因是肿瘤抑制基因，不少研究表明NF1基因突变可通过干扰Ras循环的cAMP信号转导通 路从而引发肿瘤。NF1基因自发突变率约为1/10000，是人类基因突变率最高的基因位点 之一，约50％患者为新突变，至今仍有未明确的突变点，但发现了一些突变集中区域。其 中外显子4b、7、10b、13、15、20、28，29，31可能为突变热点，而32号外显子突变可 能是中国人NF1基因突变热点区域之一。目前发现的基因突变已超过700多种，包括碱基 的转换、颠换、插入、缺失、移码突变、拼接突变及染色体平衡易位等。在这些突变中， 约有82％突变造成神经纤维蛋白的截短，蛋白的截短对蛋白的功能结构产生重要的影响。

目前，针对I型神经纤维瘤病高发病率检测的需求日益增加，设计研究科学合理且精 准的检测试剂盒十分必要。由于NF1基因片段较大，突变情况复杂，易造成漏检。而该病不同患者的临床表现不同，且同一家族的不同患者临床表现也不同，大大增加了临床诊断的难度，因此建立快速且准确的诊断技术、攻克I型神经纤维瘤病的诊断难题，对其临床 治疗和科学研究都具有重要的价值。

但目前所发现的突变热点不足以解决临床上I型神经纤维瘤病基因筛查、诊断的难题。 寻找新的致病突变，丰富NF1神经纤维瘤病突变谱，将为临床上方便快捷的筛查和诊断I 型神经纤维瘤病患者提供重要的靶点及理论依据，这一直是本领域研究人员孜孜不倦的探 究领域。

由于NF1基因包含58个组成性外显子和3个可变剪接外显子，传统的针对每一个外显子的测序分析方法耗时长，每个测序样本完成检测一般需六、七天。而其他检测方法如NGS、FISH或MLPA等，需配备价格昂贵的大型仪器设备，实验条件要求高，导致检测 成本大大升高。

另外，NF1基因的突变类型除点突变外，还存在大片断缺失、一个或多个外显子的重 复/缺失等多种类型。通过单一方法检测NF1基因突变易漏检，这也是目前NF1致病基因突变检测困扰临床遗传诊断人员的一个难题。

综上所述，寻找对诊断有效的新致病突变，并研制省时、精准、且实验条件要求较低 的诊断试剂对NF1基因突变全面检测，是解决I型神经纤维瘤病诊断难题的根本方法。