[发明专利]一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

（1）将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；

（2）对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞；

所述人多能干细胞为人胚胎干细胞H9细胞系或人诱导多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸的方法为将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G的方法为基因组定点编辑；

所述基因组定点编辑的方法可为ZFN编辑、TALEN编辑、CRISPR/Cas9编辑或HdADV介导的定点编辑。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因组定点编辑的方法为HdADV介导的定点编辑。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

步骤（2）中，所述定向诱导分化的方法包括如下步骤：

（b1）将NRF2基因增强型的多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；

（b2）培养所述拟胚体至纤维状细胞出现；再经过传代培养，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述NRF2基因增强型的间充质干细胞。

6.利用权利要求1-5中任一所述方法制备获得的NRF2基因增强型的间充质干细胞。

7.利用权利要求1-5中任一所述方法制备获得的NRF2基因增强型的多能干细胞。

8.权利要求6所述的NRF2基因增强型的间充质干细胞或权利要求7所述的NRF2基因增强型的多能干细胞在如下c1）-c5）中任一种中的应用：

c1）制备抵抗和/或延缓细胞衰老的产品；

c2）制备抵抗肿瘤发生的产品；

c3）制备抵抗恶性成瘤转化的产品；

c4）制备细胞移植治疗的产品；

c5）制备再生和/或修复损伤血管的产品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述抵抗和/或延缓细胞衰老体现在如下d1）-d6）中任一种：

d1）在外源刺激物刺激下细胞活力增强；

d2）在体外连续传代培养过程中表现更强的增殖能力；

d3）清除有害代谢物的能力增强；

d4）与细胞衰老相关基因的表达水平降低；

d5）具有更完整的细胞核结构；

d6）在人或动物体内存留时间更长；

所述抵抗恶性成瘤转化体现在如下e1）-e3）中的任一种：

e1）瘤化细胞增殖能力降低；

e2）与肿瘤形成相关的非锚定依赖的生长能力降低；

e3）在体内形成肿瘤的能力降低；

所述细胞移植治疗为细胞移植修复治疗。

10.一种产品，其活性成分为权利要求6所述的NRF2基因增强型的间充质干细胞；

所述产品的功能为如下m1）-m5）中任一种：

m1）抵抗和/或延缓细胞衰老；

m2）抵抗肿瘤发生；

m3）抵抗恶性成瘤转化；

m4）细胞移植治疗；

m5）损伤血管的再生和/或修复。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于：

所述抵抗和/或延缓细胞衰老体现在如下d1）-d6）中任一种：

d1）在外源刺激物刺激下细胞活力增强；

d2）在体外连续传代培养过程中表现更强的增殖能力；

d3）清除有害代谢物的能力增强；

d4）与细胞衰老相关基因的表达水平降低；

d5）具有更完整的细胞核结构；

d6）在人或动物体内存留时间更长；

所述抵抗恶性成瘤转化体现在如下e1）-e3）中的任一种：

e1）瘤化细胞增殖能力降低；

e2）与肿瘤形成相关的非锚定依赖的生长能力降低；

e3）在体内形成肿瘤的能力降低；

所述细胞移植治疗为细胞移植修复治疗。