[发明专利]一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的NRF2基因增强型的间充质干细胞的制备方法。本发明首次利用基因编辑技术成功改造抗逆相关基因，仅单一编码位点修饰便实现内源抗逆基因可控的主动激活，获得了抗逆特性提高的基因增强型间充质干细胞，并通过体内体外实验证明了基因增强型干细胞能够抵抗逆境及细胞衰老，具有更佳的组织修复功能以及抵抗恶性成瘤转化的能力。本发明的方法同时解决了细胞移植治疗中有效性与安全性两大关键和瓶颈性难题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法。

背景技术

细胞移植治疗是近年来再生医学领域最具前景和潜力的发展方向。细胞移植旨在补充或替代体内因疾病或衰老等因素导致的本已耗竭或失去正常功能的细胞，移植的细胞在体内存活并发挥正常功能，恢复组织内稳态，进而实现组织修复和再生。尽管细胞移植治疗已经在诸如骨髓干细胞移植治疗白血病等方面表达出极佳的治疗效果，但其更广泛的应用仍面临许多问题的挑战。目前，限制细胞移植治疗的主要因素集中在有效性和安全性两方面。

细胞移植治疗的有效性主要体现在移植物移植前的质量及进入体内后能否存活整合并发挥再生功能。一方面，移植物在体外培养过程中存在一定的“寿命”，具体表现为持续受到复制压力影响，有限的连续传代后迅速进入细胞老化(cellular senescence)状态，停止增殖且失去功能。另一方面，细胞移植的部位普遍位于疾病或衰老的组织微环境中，其中的炎性因子、有害代谢产物等会损害外源移植物。以上两方面都会导致细胞发生严重的功能性衰退，导致移植效率低下。细胞移植治疗的安全性主要集中在长期移植后的致瘤风险。细胞移植物在病体中持续受到压力胁迫，基因组可能变得极不稳定，若在癌基因或抑癌基因上发生突变，可能演变为癌症，形成安全隐患。

如何通过特定的干预手段提高细胞移植治疗的效率，尽可能的降低致瘤风险一直以来都是再生医学能够广泛应用的决定性问题。然而，迄今为止尚未发展出简单有效的方法克服这一技术瓶颈。当前提高细胞移植效果的尝试主要集中在改善移植部位微环境和增强移植物“抗逆”特性两方面。许多研究通过在不利细胞发挥正常功能的病体微环境中补充外源“营养及保护因子”的方式来改善移植效果，但该方法仅能在短期内改善移植环境，移植复发等不良预后问题突出。与此相比，通过特定方法改善移植物的“内因”，即增强移植材料自身固有的抵抗逆境能力来实现移植效果的改善是更为直接和长效的手段。目前已有少数研究表明可以利用慢病毒或逆转录病毒载体导入抗逆相关蛋白，调控细胞内特定的信号通路或基因表达，增强细胞对逆境的抵抗，进而实现细胞移植治疗效果的提升。尽管一系列临床前研究证明了提高细胞固有抗逆特性的可行性，但整合型病毒载体介导的基因调控必然存在基因组的随机整合，基因突变风险加大，安全性堪忧，这大大削弱了其在临床上的应用价值。

基因靶向编辑技术的发展极大的推动了细胞移植治疗的进步。这一技术使得人们可以精确的编辑基因组上的遗传密码，目前已有大量利用基因靶向编辑技术矫正疾病细胞致病突变的案例被报道。恢复正常功能的基因矫正细胞经体外扩增可以用于自体移植，是细胞移植治疗中绝佳的材料。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的NRF2基因增强型的间充质干细胞的制备方法。

本发明提供的间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：

(1)将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；

(2)对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞。

上述方法中，步骤(1)中，所述将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82 位的谷氨酸突变为甘氨酸的方法为将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G；所述NRF2基因的第245位为NRF2基因编码区的第245位。