[发明专利]D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用和反应产物

说明书

本发明提供催化活性显著提高的FSAA突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和基因工程菌，通过这些FSAA突变体或含有相应突变体蛋白的基因工程菌不对称催化肉桂醛/α‑溴肉桂醛/4‑硝基肉桂醛/吡啶‑2‑甲醛和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应可制备高光学纯度的手性产物，后者可作为有价值的手性砌块，在医药领域具有重要的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及D-果糖-6-磷酸醛缩酶A的分子改造，获得突变体、重组表达载体，基因工程菌以及不对称催化肉桂醛/α-溴肉桂醛/4-硝基肉桂醛/吡啶-2-甲醛和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。

背景技术

不对称直接羟醛缩合反应是一类非常重要的C-C加成反应。其产物为天然多羟基化合物或全新的多羟基小分子。由于羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团，这些多羟基小分子成为最重要的手性砌块之一，尤其是在医药领域具有重要的应用价值。这其中，(3S,4R,E)-3,4-二羟基-6-苯基-5-己烯-2-酮(3a,式1)是从头合成C-苯基-β-L-古洛糖苷和C-苯基-α-L-甘露糖苷的重要手性前体。后两者是糖苷酶和糖基转移酶的有效抑制剂，具备潜在的抗细菌、抗肿瘤和抗真菌的能力，因此3a的不对称合成具有重要的药用价值。当前3a的合成路径主要依赖于化学催化的肉桂醛和羟基丙酮的羟醛缩合反应。涉及到的催化剂多为硼化物、钛化合物、手性叔胺、NaOH和铟-硝化汞复合体系，转化率相对较高，但是立体选择性不足。由于该反应生成了两个新的功能性手性中心，对该反应手性化学的绝对控制便显得尤为重要。因此，肉桂醛和羟基丙酮缩合的高立体选择性是化学催化该反应的主要障碍。从另一方面而言，生物催化因具有催化效率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为绿色化学合成的优选途径。这其中，醛缩酶作为一类能够天然催化羟醛缩合反应的催化剂，具有很高的催化效率和立体选择性，因此可作为不对称合成(3S,4R)-3a的首选途径。

在具有催化不对称直接羟醛缩合反应能力的醛缩酶中，D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)能够以非磷酸化的羟基丙酮(HA)、二羟基丙酮(DHA)和羟基丁酮(HB)作为底物，而非相对昂贵且制备较为繁琐的磷酸二羟基丙酮(DHAP)，后者是DHAP依赖型醛缩酶的催化底物。此外，FSAA催化产物具有很高的光学纯度，因此该酶一经报道便获得了广泛的关注。本课题组前期以肉桂醛和HA作为底物筛选醛缩酶，首次发现FSAA具备高立体选择性催化该反应的能力，同时FSAA对肉桂醛类似物，α-溴肉桂醛、对硝基肉桂醛和吡啶-2-甲醛也表现出了相应的催化活力。但是，可能由于肉桂醛及取代肉桂醛结构较为特殊，具有一个与苯环共轭的双键，产生的电子离域效应降低了肉桂醛及取代肉桂醛作为底物的反应活力，导致FSAA催化上述反应的活力远不能满足工业化生产要求，因此，有必要通过相关技术提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。

发明内容

本发明的目的是首次以酶分子作为生物催化剂的肉桂醛与HA间的羟醛缩合反应，此外为这些反应提供强有力的生物催化剂，即酶活提高的FSAA的突变体及其重组大肠杆菌。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种催化活性显著提高的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)的突变体。这些突变体是在SEQ ID No:2所示醛缩酶FSAA氨基酸序列基础上进行构建，该醛缩酶核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

具体的，所述突变体是在在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列上第59位点谷氨酰胺(Gln59)进行不同的取代。

优选的，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的氨基酸序列选自下列突变序列：

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，第59位突变为亮氨酸(Gln59Leu,即Q59L)；

SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，第59位突变为苏氨酸(Gln59Thr,即Q59T)。