[发明专利]一种基因同源重组修复报告系统及建立方法

权利要求书

1.一种基因同源重组修复报告系统，其特征在于，包括报告细胞系和基因同源重组修复模板AAV，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293-GFP(510_513delAAC)或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系，报告细胞系由慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)感染HEK-293或HT-1080细胞获得，慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)由重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)、辅助质粒pVSVg和psPAX2共转入HEK-293T细胞获得，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)包含GFP(510_513delAAC)基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因，GFP(510_513delAAC)基因位于pSin-EF2-LIN28-Pur载体上的IRES基因和EF1α启动子之间，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1；

基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2-pMC1TK-GFP-Ires-Puro，该质粒包含GFP-Ires-Puro序列和pMC1-TK序列，这2段序列位于AAV载体中的两个ITR序列之间，GFP-Ires-Puro序列如SEQ ID NO.2，pMC1-TK序列如SEQ ID NO.3。

2.一种基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，包括报告细胞系的建立和基因同源重组修复模板AAV的建立，其中，基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2-pMC1TK-GFP-Ires-Puro，该质粒包含GFP-Ires-Puro序列和pMC1-TK序列，这2段序列位于AAV载体中的两个ITR序列之间，GFP-Ires-Puro序列如SEQ IDNO.2，pMC1-TK序列如SEQ ID NO.3，

报告细胞系的建立方法为：

1)构建重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)包含GFP(510_513delAAC)基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1，GFP(510_513delAAC)基因位于pSin-EF2-LIN28-Pur上的IRES基因和EF1α启动子之间：

2)将重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)、辅助质粒pVSVg和psPAX2共转入HEK-293T细胞，获得慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)；

3)用慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)感染HEK-293或HT-1080细胞，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293-GFP(510_513delAAC)或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系。

3.根据权利要求2所述的基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293-GFP(510_513delAAC)或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系的方法为：

1)HEK-293或HT-1080细胞计数后接种于6孔板；

2)细胞生长24h后，在6孔板中加入适量的慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)，同时加终浓度为4μg/ml的聚凝胺(polybrene)；

3)HEK-293或HT-1080细胞感染慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)12h后换液，48h后传代，稀释后接种到10cm皿，用1ug/ml浓度的抗生素嘌呤霉素(Puromycin)筛选；

4)10天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293-GFP(510_513delAAC)或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系。

4.根据权利要求3所述的基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，6孔板中的细胞密度为3.0×10⁵细胞/孔。