[发明专利]一种基因同源重组修复报告系统及建立方法

说明书

本发明公开一种基因同源重组修复报告系统及建立方法，系统包括报告细胞系和基因同源重组修复模板AAV，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK‑293或HT‑1080‑GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1；基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2‑GFP‑pMC1TK，pA2‑GFP‑pMC1TK包含不含启动子的GFP和Puro基因。建立方法为包括报告细胞系的建立和基因同源重组修复模板AAV的建立。通过采用基因同源重组修复模板AAV感染报告细胞系的细胞后，用流式细胞术检测基因修复后恢复绿色荧光细胞的比率，以此来评估基因同源重组修复的效率。利用此系统可以在体外快速、有效、高通量筛选靶向HRR相关的分子，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，HRR机制进行深入研究。

技术领域

本发明涉及细胞工程与病毒学领域，涉及一种基因同源重组修复报告系统及建立方法。

背景技术

细胞基因组在染色体自我复制的过程中由于受到各种内源性或者外源性因素的影响，存在多种形式的损伤，并由此引发一系列细胞学反应。DNA的损伤类型很多，其中以DNA双链断裂(double strand break，DSB)最为严重。且DNADSB的修复比其他类型的DNA损伤更加困难，不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡，而错误修复则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等。DNA损伤的不完全修复可导致基因组不稳定，机体细胞为了对抗损伤，进化出多个修复系统来确保基因组的完整性，其中同源重组修复(homologousrecombination repair，HRR)是DNA DSB损伤修复的主要方式。HRR主要发生在有丝分裂的S期和G2监测点，因DNADSB而导致断裂DNA末端与姊妹染色单体进行结合并进行修复。

肿瘤是严重危害人类生命和健康的一类疾病，其发生发展是个复杂过程。基因组的修复对于肿瘤细胞的生长特别重要，而基因HRR对于保持基因组稳定性的必不可少。有研究表明HRR修复缺陷的细胞对于药物，如顺-二氯二氨络铂(Cisplatin)，卡波铂(Carboplatin)和亚硝基脲(Nitrosoureas)超敏感。这提示着，与HRR相关的分子理论上很可能可以成为临床肿瘤治疗的靶标。因此，如何从大量小分子中筛选出靶向HRR相关的分子显得十分有意义，而限制该研究重要的难点是需要建立能在体外快速、有效、高通量的HRR报告系统来达到靶向筛选的目的。

发明内容

本发明的目的是建立一种基因同源重组修复报告系统，以解决不能在体外有效、快速、高通量筛选出靶向HRR相关分子的瓶颈，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，HRR机制进行深入研究。

具体地，根据本发明的一个方面，提供了一种基因同源重组修复报告系统，包括报告细胞系，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1。GFP(510_513delAAC)基因为GFP(绿色荧光蛋白)基因510bp位置缺失AAC碱基序列而绿色荧光失活的GFP突变体，所述GFP突变体基因由申请人筛选获得。

所述报告系统还包括基因同源重组修复模板AAV，其为腺相关病毒(AAV)包装的同源重组修复模板质粒pA2-GFP-pMC1TK，pA2-GFP-pMC1TK载体包含不含启动子的GFP(绿色荧光蛋白)和Puro基因。

一种基因同源重组修复报告系统的建立方法，包括报告细胞系的建立：

1)构建重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)包含GFP(510_513delAAC)基因，IRES基因和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因：