[发明专利]一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白及其制备方法和应用，包括重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白的表达载体、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白的制备方法、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白、重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白在体外诊断I型过敏症方面的应用；本发明还提供了检测过敏原特异性IgE抗体的试剂盒以及检测方法。本发明的重组融合碱性磷酸酶‑过敏原蛋白其蛋白结构、理化特征更接近天然过敏原蛋白，因此检测灵敏度高，非特异性少；绝对避免传统标记批间差，简化了标记物的生产过程；简化了关键原料的制备过程，降低了生产成本，提高了过敏原的活性，节省了试剂盒使用的操作步骤和时间。

技术领域

本发明涉及体外免疫诊断技术领域，具体涉及一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用，特别是涉及重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在IgE体外检测试剂盒方面的应用。

背景技术

过敏症多为IgE介导的对自然界中抗原分子产生的不良免疫反应。正常情况下，血液中检测不到对一种过敏原具有特异性的IgE，仅在人体被外界抗原物质致敏后产生。引起过敏反应的物质过敏原可诱导产生一种特异性的IgE，其只与该物质发生反应。sIgE(specific IgE，特异性IgE)与过敏原结合后引起细胞释放组胺，组胺引发过敏症，如哮喘、湿疹、皮疹、眼部发痒、鼻炎、流涕等，严重者甚至昏迷、休克。

传统的过敏原体内诊断试验通常具有较高的特异性和敏感性，但易受抗过敏药物和皮肤状况等影响，同时操作程序易诱发严重过敏反应，且需丰富经验的专业医生诊断，因此安全性不高。体外诊断测血清sIgE，具有安全可靠的优点，是临床常用的IgE介导的I型变态反应性疾病特异性诊断方法，具有重要的临床意义。真正意义上根据实际检测数据进行过敏原分级的检测方法只有酶联免疫荧光法和酶联免疫捕获法。酶联免疫捕获法检测总IgE和sIgE结果符合性良好，对过敏性疾病具有良好的诊断价值，操作过程中依靠酶标仪就能得到可靠的结果，而且成本适中，性价比高，有效减轻了患者的经济负担。

过敏原体外诊断的传统方法，酶联免疫法如ALLERgen系统，其原理如下：抗人IgE包被酶标板，吸附样品中总IgE和特异性IgE，再与标记的过敏原形成抗体抗原复合物，最后经酶与底物显色以检测样品中IgE的含量。首先，加入样品孵育使酶标板结合所有的IgE抗体，然后洗涤，避免其他免疫球蛋白如IgG抗体的干扰，再加入生物素标记的过敏原使其与IgE特异性结合，洗涤除去未结合生物素抗原，然后加入标记了辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的链霉亲和素标记结合物，洗涤除去未结合标记结合物，加入显色底物，通过酶与底物反应后吸光度或者发光强度的变化来检测针对特异性过敏原的IgE的量。

现有试剂盒的标记抗原主要是过敏原的天然提取物或重组蛋白。由于提取物纯度不足，时有蛋白酶残留，造成提取物不稳定，其中含有的杂蛋白会造成假阳性。重组过敏原成分单一浓度高，有利于提高过敏原检测的灵敏度。重组过敏原相对于天然提取物就其生产方式而言更利于进行标准化，且在不同的生产批次之间的差别更小、更稳定。

重组过敏原的表达方式主要分为原核表达、酵母表达、昆虫细胞、哺乳细胞表达、植物细胞表达，原核表达产量高，但无法对重组蛋白进行一些必要的修饰，且表达产物若是包涵体，则蛋白难以复性。利用真核细胞表达过敏原，蛋白质能正确折叠，可提供复杂又准确的糖基化修饰功能，因此表达产物在分子结构、理化性质及生物学功能方面最接近于天然的高等蛋白质分子，但是相对来说，表达产量低，纯化困难，蛋白浓度较高才能够进行生物素化标记，标记之后还需要纯化，除去未标记物等，总的来说操作复杂、成本较高。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白及其制备方法和应用，特别是涉及重组融合碱性磷酸酶-过敏原蛋白在IgE体外检测试剂盒方面的应用。本发明提供的方法能克服现有技术缺点，实现生产简单、成本低和高灵敏度。