[发明专利]一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法有效
| 申请号： | 201611221446.2 | 申请日： | 2016-12-26 |
| 公开（公告）号： | CN106755424B | 公开（公告）日： | 2020-11-06 |
| 发明（设计）人： | 段广才;龙金照;徐亚珂;梁文娟;刘慧莹;陈帅印;杨海燕;郗园林 | 申请（专利权）人： | 郑州大学;新乡医学院 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11 |
| 代理公司： | 郑州睿信知识产权代理有限公司 41119 | 代理人： | 牛爱周 |
| 地址： | 450001 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr 大肠杆菌 st131 菌株 检测 引物 试剂盒 方法 | ||
1.大肠杆菌ST131系菌株的非诊断目的的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；
2）回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系细菌阳性；
步骤1）中引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：当以待测样本基因组DNA为模板时，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，5~10ng/μL待测样本DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：当以待测样本单菌落为模板时，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，补加灭菌超纯水至25μL。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于：步骤1）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃继续延伸10min。
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