[发明专利]一种小分子药物控制的蛋白功能开关系统

说明书

本发明公开了一种小分子药物控制的蛋白功能开关系统。该系统包含一个高度特异的蛋白酶，可识别并切割目标蛋白内特定的氨基酸序列。该蛋白酶的在体内的合成可由一个小分子药物调控。利用此小分子药物可精确调节目标蛋白的生物学活性。本发明发现并确证，目标蛋白与病毒蛋白酶融合表达，本调控系统的效率更高，反应更快。病毒蛋白酶可以是天然的蛋白酶也可以经过遗传改造，减小蛋白酶分子量，或是连入一个降解子结构域(degron)，促进蛋白酶自身的分解。病毒蛋白酶抑制剂的选择主要为市面上用于治疗或进入临床实验的药物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种小分子药物控制的蛋白功能开关系统。

背景技术

细胞内不同的蛋白行使着不同的功能，而要研究其功能，通常是用某些方法干扰其行使功能，观察其反应。目前常用的方法是在基因组或转录水平操纵细胞内特定基因的表达，但是直接在蛋白水平的调控研究相对较少。直接对胞内蛋白的功能进行操作具有灵敏、快速、可逆、可控性、简便等方面的优点。结合遗传操作的特异性和基于小分子药物调控的方法，可在时间和空间上对细胞或组织特定蛋白进行精确控制，从而减少不必要的副作用。如蛋白在细胞内的定位、蛋白分子的激活或抑制、稳定或降解，细胞内特定信号通路的激活或阻断等。目前，蛋白功能调控方式主要分为三类：①利用小分子或光调控两个异源二聚体的结合或解离；②利用小分子调控蛋白结构变化；③利用小分子调节控制蛋白的稳定性。下面分别介绍各个类型蛋白功能调控所涉及到的技术：

(1)利用小分子控制两个异源二聚体的结合或解离

在过去二十年中，化学小分子已经作为调控蛋白质-蛋白质相互作用的有效手段。这些化合物被称为二聚化的化学诱导物(chemical inducers of dimerization，CID)，具有同时结合两个蛋白质结构域的能力，从而诱导它们的相互接近。CID已经用于：①促进或抑制特定基因的转录活性；②将靶蛋白募集到细胞内特定区域；③调控蛋白质聚集和解聚。

1991年Liu等人发现了第一个CID——免疫抑制剂药物FK506。这个小分子通过同时结合FK506结合蛋白(FKBP12)和钙依赖磷酸酶，抑制T细胞受体介导的信号传导。在此基础上，将FK506合成二聚体(命名为FK1012)，其能够使FKBP12二聚化。FKBP12与T细胞受体的ζ链的融合可实现快速的，可调节的和可逆的FK|012依赖的信号转导调节。而目前研究最充分的CID为雷帕霉素(rapamycin)，这是一种大环内酯天然产物，介导FKBP12与mTOR的FRB结构域之间的相互作用。如果将两种感兴趣的蛋白质分别与FKBP和FRB融合表达，可在雷帕霉素存在的情况下相互靠近，雷帕霉素在低剂量条件下就可快速实现FKBP-FRB的结合。然而，细胞内源性FKBP和mTOR会与FKBP和FRB融合蛋白竞争结合雷帕霉素，导致无效的相互作用。雷帕霉素与mTOR的结合还会导致细胞周期的停滞。为了减轻其脱靶效应，通过将雷帕霉素衍生化以及FKBP或FRB结构域进行定点突变，优化获得Rimiducid调控FKBP-FRB二聚化的方法可有效降低CID脱靶效应。

最近，一些新的蛋白质-配体对的发现促进了CID系统的发展。例如，地塞米松-甲氨蝶呤(Dex-Mtx)复合物可诱导糖皮质激素受体(GR)和二氢叶酸还原酶(DHFR)之间的相互作用。令人遗憾的是，Mtx是DHFR的抑制剂，这限制其应用。经过改进后，甲氧苄啶-SLF(TMP-SLF)化合物可触发DHFR-FKBP12融合体之间的相互作用。该化合物不结合内源性蛋白质，但这些小分子是昂贵的并且需要多步合成，这限制了它们的广泛应用。近年来，科学家发现一些植物激素可有效调控目标蛋白的结合与解离。脱落酸(ABA)是刺激植物发育的激素之一。它通过结合pyribactin resistance(PYR)/PYR1-like(PYL)，抑制蛋白磷酸酶(PP2Cs)。将PYL和PP2C结构域分别与DNA结合结构域Gal4和转录激活结构域VP64融合后，可以重建Gal4转录活性。另一种植物激素——赤霉素(GA3)也可以用作CID。GA3可结合GID1，促进其和GAI之间的相互作用。植物激素相对经济，安全和反应灵敏，使其具有一定的应用价值。