[发明专利]一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法

权利要求书

1.一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）多基因植物表达载体的构建

构建pABA-oriT载体，该载体的T-DNA中的克隆基因表达盒包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

所述5种抗逆功能基因包括：2个ABA合成相关基因NCED3、LOS5，1个ABA信号途径相关基因ABAR，2个抗冻调节基因 ICE1、CBF3；

所述3种选择标记基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草铵膦抗性基因 BAR；

5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA-oriT载体T-DNA区的具体排列顺序为：LB-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

（2）对步骤（1）中所构建的重组表达载体的鉴定，确保5种功能基因共存于同一表达载体中；

重组表达载体鉴定时，采用PCR鉴定法，PCR鉴定时，引物序列设计如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

（3）对步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体转化农杆菌，制备转化液；

（4）采用农杆菌介导的浸花法转化油菜，转化后，继续培育至成熟，按单株收获种子；转化油菜时，花序在转化液中每次浸泡90~120秒；转化操作时，隔天转化1次，连续转化3次；

（5）转化体的筛选和鉴定，将步骤（4）中所收获油菜种子播种，依次进行Basta抗性、潮霉素抗性筛选，并对双抗性植株进行PCR鉴定；

（6）转化体自交获得纯合体，对步骤（5）中筛选、鉴定正确的转化体继续培养，于花期时套袋，使其自交，收获单株种子；

对收获的种子继续种植，同步骤（5）操作，继续进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定，并对鉴定正确的转化体继续自交，经不少于4代的连续自交鉴定，最终获得转化纯合体，即为具有综合抗逆特性的转基因油菜。

2.如权利要求1所述多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其特征在于， 步骤（4）中，所述油菜品种为甘蓝型油菜Y42。

3.一种具有综合抗逆性油菜新品种的培育方法，其特征在于，该方法以甘蓝型油菜Y42为基础，通过利用多基因叠加共转化来提高油菜综合抗逆性，所述多基因叠加共转化包括如下步骤：

（1）多基因植物表达载体的构建

构建pABA-oriT载体，该载体的T-DNA中的克隆基因表达盒包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

所述5种抗逆功能基因包括：2个ABA合成相关基因NCED3、LOS5，1个ABA信号途径相关基因ABAR，2个抗冻调节基因 ICE1、CBF3；

所述3种选择标记基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草铵膦抗性基因 BAR；

5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA-oriT载体T-DNA区的具体排列顺序为：LB-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

（2）对步骤（1）中所构建的重组表达载体的鉴定，确保5种功能基因共存于同一表达载体中；

重组表达载体鉴定时，采用PCR鉴定法，PCR鉴定时，引物序列设计如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

（3）对步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体转化农杆菌，制备转化液；

（4）采用农杆菌介导的浸花法转化油菜，转化后，继续培育至成熟，按单株收获种子；转化油菜时，花序在转化液中每次浸泡90~120秒；转化操作时，隔天转化1次，连续转化3次；

（5）转化体的筛选和鉴定，将步骤（4）中所收获油菜种子播种，依次进行Basta抗性、潮霉素抗性筛选，并对双抗性植株进行PCR鉴定；

（6）转化体自交获得纯合体，对步骤（5）中筛选、鉴定正确的转化体继续培养，于花期时套袋，使其自交，收获单株种子；

对收获的种子继续种植，同步骤（5）操作，继续进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定，并对鉴定正确的转化体继续自交，经不少于4代的连续自交鉴定，最终获得转化纯合体，即为具有综合抗逆特性的转基因油菜。