[发明专利]一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法

说明书

本发明属于植物基因工程研究技术领域，具体涉及一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法。该方法包括：多基因植物表达载体的构建、载体的鉴定、载体转化农杆菌、制备转化液、浸花法转化油菜、筛选、鉴定、自交获得纯合体等步骤；所述多基因植物表达载体中，包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因，具体排列顺序为：LB‑HYG–GUS‑BAR‑ICE1‑LOS5‑CBF3‑ABAR‑NCED3‑RB。本发明通过优化抗性基因组合，并将多个抗逆关键节点基因构建于同一表达载体中。在将该载体转化植物体后，一次转化即可使植物体能够同时适应多种逆境条件，提高植物的综合抗逆能力，表现较好的生产应用价值。

技术领域

本发明属于植物基因工程研究技术领域，具体涉及一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法。

背景技术

油菜属十字花科 (Cruciferae) 芸薹属 (Brassica)，是世界上最重要的油料作物之一，其应用遍及生产生活的各个领域。当前油菜育种工作者面临的主要问题是培育油菜高抗新品种来适应因全球气候变化导致的非生物和生物胁迫日渐频繁等问题。利用遗传工程改良油菜品种在一定程度上克服了传统育种模式基因交流范围局限性的问题，是油菜育种工作可资利用的有效途径之一。

干旱、盐碱化、极端气候等非生物胁迫严重影响作物产量潜力的发挥。干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。因此，如何通过提高作物的抗逆能力来增加作物产量，已成为农业可持续高效发展的重大需求。作物抗逆育种的主要任务就是聚合存在于不同种质资源中的有利基因，为农业生产培育优良的品种。由于植物耐逆性是多基因控制的复杂的数量性状，不同抗逆信号通路之间又存在交叉对话，因此，相对于单基因转化，将抗逆信号通路中的关键节点基因采用多基因叠加共转化的方式提高植物的抗逆性具有许多不可替代的优点。但现有技术中尚未见到这一方面较好的应用报道。

发明内容

本发明目的在于一种多基因叠加共转化以提高油菜综合抗逆性的方法，该方法通过多基因叠加共转化，将含五种抗逆基因表达载体同时转入油菜，从而提高油菜对多种胁迫的综合适应能力。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，包括如下步骤：

（1）多基因植物表达载体的构建

通过Gateway技术，结合Cre/Loxp重组系统和λ噬菌体位点特异性重组系统，以多轮重组叠加的方式构建了pABA-oriT载体，该载体的T-DNA区的克隆基因表达盒包含了依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

所述5种抗逆功能基因包括：2个ABA合成相关基因NCED3、LOS5，1个ABA信号途径相关基因ABAR，2个抗冻调节基因 ICE1、CBF3；

所述3种选择标记基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草铵膦抗性基因 BAR；

5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA-oriT载体T-DNA区的具体排列顺序为：LB-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

需要解释的是：

5种抗逆功能基因由2类启动子进行驱动表达，具体而言：