[发明专利]一种人源性asprosin蛋白的ELISA检测试剂盒及其用途有效
| 申请号： | 201611226603.9 | 申请日： | 2016-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN106645750B | 公开（公告）日： | 2018-09-14 |
| 发明（设计）人： | 李博;陈书强;王晶晶 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N33/543;G01N33/532 |
| 代理公司： | 西安智邦专利商标代理有限公司 61211 | 代理人： | 胡乐 |
| 地址： | 710032 陕西*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人源性 蛋白 多克隆抗体 检测设备 酶标板 试剂盒 二抗 多囊卵巢综合征 封闭缓冲液 抗体稀释液 生物素标签 洗涤缓冲液 阳性对照品 样品稀释液 阴性对照品 动物标本 辅助诊断 快速检测 特异性强 标准品 酶标仪 敏感度 显色液 移液器 再配置 终止液 包被 构建 温箱 一抗 耗时 并用 封闭 | ||
1.一种人源性asprosin蛋白的ELISA检测试剂盒在构建用于辅助诊断多囊卵巢综合征(PCOS)的检测设备体系方面的用途，该检测设备体系还包括37℃温箱、移液器和酶标仪；其特征在于：ELISA检测试剂盒中包含人源性asprosin蛋白的多克隆抗体，在制备所述人源性asprosin蛋白的多克隆抗体的过程中采用了说明书表1中限定的优化后基因序列和引物进行PCR扩增以得到所述人源性asprosin蛋白；在多囊卵巢综合征(PCOS)患者的血浆中，asprosin蛋白的含量显著高于正常人群。
2.根据权利要求1中所述的用途，其特征在于：所述人源性asprosin蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，根据asprosin基因序列、以及大肠杆菌原核蛋白表达的偏好，在保证asprosin基因的氨基酸序列一致的前提下，设计得到所述优化后基因序列和引物，进行PCR扩增；以下asprosin简称A；
步骤二，将PCR扩增到的A基因和载体质粒pET15b和分别用Nde I和Xho I双酶切并分别回收，之后将A基因的酶切产物连接到酶切后的pET15b载体质粒上，得到pET15b-A重组质粒，转化到大肠杆菌DH5α感受态菌株，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行Nde I和Xho I双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得序列序列正确的pET15b-A重组质粒进行保存；
步骤三，将步骤二所述的测序正确的pET15b-A重组质粒转化至大肠杆菌BL21表达宿主菌体中，优化重组A蛋白的诱导条件；
步骤四，超声破碎步骤三所述的BL21表达宿主菌体，12000rpm，4℃，离心20min，收集沉淀后用包涵体溶解液进行重溶，之后采用12％的SDS-PAGE胶检测重组A蛋白的表达情况；
步骤五，采用Ni-琼脂糖亲和层析法，纯化步骤四所述的重组A蛋白，采用12％的SDS-PAGE胶检测重组A蛋白的纯化效果；
步骤六，用步骤五纯化得到的A蛋白免疫健康雌性新西兰大白兔，初免蛋白剂量为0.5mg/只，二免、三免、四免蛋白剂量为0.25mg/只，初免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化，二免、三免、四免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化；
步骤七，四免后，耳静脉采血1ml，ELISA检测抗体效价，效价达到要求，第二天颈动脉放血收集抗血清；
步骤八，亲和层析法纯化抗血清中的抗体，ELISA检测纯化后所得抗体的效价，确定最佳的抗体稀释比。
3.根据权利要求2中所述的用途，其特征在于：步骤三优化的诱导条件，确定为在菌液OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，37℃诱导4h。
4.根据权利要求2中所述的用途，其特征在于：在待用的多克隆抗体上添加生物素标签。
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