[发明专利]一种评价人乙型肝炎病毒X蛋白结合分子的方法

说明书

本发明属于生物技术及基因工程领域，涉及一种评价人乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)结合分子的方法。本发明方法包括在细胞内表达分泌型的包含HBx蛋白和荧光素酶NanoLuciferase(Nluc)两者的融合蛋白，通过检测分泌的融合蛋白的萤光素酶活性，量化分泌的HBx蛋白的水平，本方法可用于筛选和鉴定HBx蛋白的结合分子，为研制HBx蛋白的靶向药物提供支持，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域，公开了一种评价人乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)结合分子的方法。本发明还公开了分泌型的含HBx蛋白和荧光素酶NanoLuciferase(Nluc)的重组融合蛋白的构建方法。本发明的技术要点为在细胞内表达分泌型的含HBx蛋白和Nluc荧光素酶的重组融合蛋白，通过检测分泌的融合蛋白的萤光素酶活性，而量化分泌的HBx蛋白的水平，该方法可用于快速筛选和鉴定HBx蛋白的结合分子，以及用于研制HBx蛋白的靶向药物。

背景技术

现有技术公开了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球范围的严重公共卫生问题之一，目前全球有3.5亿HBV慢性携带者，每年约1百万人死于HBV感染所引发的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(Lavanchy 2004)。资料显示，中国属HBV感染高流行国家，约有0.9亿慢性HBV携带者和3000万慢性乙型肝炎患者(Liu 2002)。

研究显示，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)由HBV的HBx基因编码，包括154个氨基酸残基(Tiollais 1985)，已知的8种HBV基因型(A型-H型)均编码相同长度的HBx蛋白。

研究公开了HBx蛋白对HBV在肝细胞中建立慢性感染是必需的，在HBV感染的肝细胞中，HBx蛋白在细胞核与细胞质均存在分布。所述HBx蛋白包含羧基端反式激活区域与氨基端调节区域，具有广泛的调控基因转录的作用(Betty L 2014)，能够被募集到HBV的cccDNA微染色体上，调节cccDNA的转录活性，激活病毒基因的表达和病毒的复制(Laura2009)，还能够与宿主细胞中包括p53、DDB1、CRM1、CHOP、CREB等在内的多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞细胞周期、增殖分化与凋亡，并能使细胞发生恶性转化，对原发性肝细胞癌的形成和发展产生影响(Tang 2006)。

目前，研究HBx功能的主要方法是通过转染HBx蛋白的过表达质粒进行相关实验，而由于高效抗体和检测试剂的限制，通常在X蛋白N端或C端添加Tag标签或者GFP蛋白；HBx蛋白的检测主要通过将表达HBx蛋白(由转染携带HBx基因的质粒表达)的细胞裂解，提取细胞抽提物，利用相应的抗体进行免疫印迹实验，检测HBx蛋白本身或HBx蛋白的结合蛋白，该检测方法耗时耗力，对操作者的技术要求高，难以用于高通量检测研究。

鉴于HBx蛋白的重要作用，针对HBx蛋白的靶向药物可能削弱其活性，从而抑制HBV的感染和复制，以及原发性肝细胞癌的发生发展，为此，极有必要建立操作简便而灵敏的筛选和评价HBx蛋白作用分子的报告系统，从而加快HBx靶向药物的研发进度。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种评价人乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)结合分子的方法，以及含HBx蛋白和荧光素酶NanoLuciferase(Nluc)的重组融合蛋白的构建方法。本发明可用于快速筛选和鉴定HBx蛋白的结合分子，以及用于研制HBx蛋白的靶向药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价人乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)结合分子的方法。本发明方法包括，在细胞内表达分泌型的含HBx蛋白和Nluc荧光素酶的重组融合蛋白，通过检测分泌的融合蛋白的萤光素酶活性，量化分泌的HBx蛋白的水平。