[发明专利]一种提高胰岛素前体产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段将人工合成的胰岛素前体通过双酶切和毕赤酵母表达载体pPIC9K相连接，构建重组菌株，通过G418抗性筛选获得高拷贝重组的含胰岛素前体的工程菌P.pastoris GS115‑PI(CL012)，并在该重组菌种共表达SNC2和Sso2基因，通过高密度发酵使得菌株的胰岛素前体产量达到78mg/L，比菌株CL012的产量提高47％。

技术领域

本发明涉及一种提高胰岛素前体产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，成为威胁人民健康的重大社会问题。胰岛素类药物是治疗糖尿病的特效必需药，但是有限的生产和巨大的需求之间的矛盾，迫切需要我们尽快找到有效策略，提高胰岛素的产量。

目前人们更多地采用大肠杆菌和酵母表达系统发酵生产重组人胰岛素前体，然后加工成有活性的重组人胰岛素。如：礼来公司利用大肠杆菌，采用16步发酵技术生产重组人胰岛素；诺和诺德公司，使用的是酿酒酵母生产中效胰岛素。大肠杆菌和酿酒酵母作为生产人胰岛素的表达系统存在着一些问题如大肠杆菌表达系统存在的问题：(1)由于大肠杆菌会产生较多自身蛋白酶，特别容易降解人胰岛素前体类似的小蛋白；(2)过表达产物会以包涵体形式在细胞质中产生，需要复杂的变性、复性加工过程，才能转变成有活性的胰岛素，增加后来处理的难度和复杂程度。酿酒酵母表达系统存在的问题：(1)酿酒酵母表达载体传代不稳定；(2)分泌表达的产物常常过度糖基化，且糖蛋白的核心寡聚糖链含α-1,3聚糖连接头，会增加产物的抗原性，不利于治疗。(3)酿酒酵母大规模发酵过程中会产生乙醇，很难进行高密度发酵培养。由于毕赤酵母表达外源蛋白时具有以下优点：(1)表达载体能在基因组特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(2)毕赤酵母具有目前最强，调控最严格启动子之一的AOX1；(3)对表达的蛋白进行翻译后加工和修饰，不会出现过度糖基化的现象；(4)可以利用简单的基础盐培养基进行高密度发酵，利于工业上的扩大生产。

毕赤酵母(Pichia pastoris)由于具有表达异源蛋白的较多优点，有望实现人胰岛素前体的高效表达。然而，由于毕赤酵母表达异源蛋白的过程中，有许多限速步骤限制异源蛋白的分泌。因此，一种调控限速过程，提高毕赤酵母中异源表达胰岛素前体(PI)的分泌能力的方法对于提高胰岛素产量具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种胰岛素前体，其氨基酸序列如SEQ ID NO,2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述胰岛素前体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种产胰岛素前体的重组菌，是以毕赤酵母为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，还表达SNC2基因或Sso2基因。

在本发明的一种实施方式中，所述SNC2基因序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述SNC2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述Sso2基因序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述Sso2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明的第四个目的是提供一种生产胰岛素前体重组菌的构建方法，所述方法是以pPIC9K为载体，将SEQ ID NO.1所示的编码胰岛素前体的基因与载体连接，在毕赤酵母中重组表达。