[发明专利]一种利用肽核酸和纳米金免标记比色检测原癌基因c‑mycmRNA的方法

说明书

技术领域

本发明属原癌基因c-myc mRNA分析检测领域，具体涉及一种利用肽核酸和纳米金免标记比色检测原癌基因c-myc mRNA的方法。

背景技术

mRNA(messenger RNA)与人类许多基因疾病密切相关，在癌症的早期阶段中往往能观测到mRNA的异常表达。因此，对特定mRNA的灵敏检测对于实现遗传性疾病(肿瘤或癌症)的早期临床诊断具有重要意义。目前mRNA的检测主要包括基于生物传感原理的荧光分析、电化学、电化学发光技术及聚合酶链式反应扩增技术等。尽管这些检测技术灵敏度较高、实用性较强，但繁琐的实验过程和昂贵的仪器装置阻碍了其在疾病诊断、环境及食品安全监测等分析检测中的应用。因此，成本低廉、操作简单、能实现现场快速测定的方法逐渐受到人们的密切关注。特别是纳米技术与DNA检测技术相结合的比色基因检测方法得到了迅猛发展，尤其是纳米金(AuNPs)凭借制备简单、粒径可控、生物兼容性好等优点在生物检测中得到广泛应用。近年来，许多工作者利用功能化AuNPs实现了对核酸，小分子和细胞的灵敏检测。这些检测基于“交联聚集”方法：利用功能化AuNPs表面的修饰配体(DNA)与目标分析物间的相互作用来克服粒子间的斥力发生聚集，由于AuNPs颜色对聚集比较敏感，通过观察颜色变化实现对目标分析物的检测。由于RNA极易被核酸酶降解，若构建基于DNA为捕获探针的“交联聚集”比色法，不仅操作步骤繁琐，而且在形成的DNA-RNA在检测过程中容易被酶分解掉。

肽核酸(PNA)是一类新的以肽键连接的寡核苷酸模拟物，N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代糖-磷酸酯的骨架在结构上很好地模拟了DNA，空间大小与天然核酸相近，加上结构方面的其他特性，PNA既保持了对核酸的特异识别能力，又比寡核苷酸具有更多的优点，主要表现如下三个方面：(1)由于PNA呈电中性，与RNA的杂交不存在静电斥力，因而PNA与RNA之间亲和性较DNA更强，结合的稳定性和特异性都大大提高；(2)PNA识别单碱基的能力强于RNA和DNA；(3)PNA抗酶解能力增强。PNA的酰胺键不同于氨基酸的肽键，其生物学性质极为稳定，而且与RNA形成的复合物不是RNA酶H的底物，不易被蛋白酶或核酸酶降解。用PNA替代DNA分子对目标RNA进行检测，具有无法比拟的优势，因此，成为本领域一直渴望解决的技术难题。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供一种利用肽核酸和纳米金免标记比色检测原癌基因c-myc mRNA的方法，解决了现有技术中操作步骤繁琐、检测过程中容易被酶分解掉的问题。

本发明的技术方案包括下述步骤：

首先在合成的酒红色纳米金溶液中加入PNA，此时溶液的颜色为蓝色，同时观察紫外吸收光谱，当加入原癌基因c-myc mRNA的有效序列与PNA杂交后，溶液的颜色又变回酒红色，同时紫外吸收光谱也恢复，由此，低达50nM靶RNA肉眼即能够检测出。

所述的纳米金(AuNPs)的合成过程为：

步骤1、取HAuCl₄·3H₂O配制50mL浓度为0.01％HAuCl₄水溶液；

步骤2、取柠檬酸钠配制1mL浓度为1％柠檬酸钠水溶液；

步骤3、将50mL 0.01％HAuCl₄水溶液加热到沸腾，剧烈搅拌下加入1.0mL1％柠檬酸钠水溶液，恒温加热搅拌15min，停止加热继续搅拌至室温，即得酒红色AuNPs溶液。

所述的AuNPs溶液的浓度为0.45nM；AuNPs粒径为13.2±0.5nm。

所述的PNA为在C端和N端未修饰的12个碱基的肽核酸序列：

12-mer PNA(N'-GCATCG TCG CGG-C')。

所述的原癌基因c-myc mRNA的有效序列为：

5’-CCG CGA CGA UGC-3’(RNA_com)。

所述的单个碱基错配的RNA序列：

5’-CCG CGA GGA UGC-3’(RNA_mis)。

本发明的优点效果如下：