[发明专利]一种花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是有黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，主要分为B₁、B₂、M₁、M₂、G₁和G₂等12，存在于土壤、动植物和各种坚果中，特别容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品。黄曲霉毒素是霉菌毒素中毒性特别大、对人类健康危害非常突出的一类霉菌毒素。黄曲霉作为黄曲霉毒素的主要产生者，从产品源头控制黄曲霉的浸染，是控制产品中黄曲霉毒素含量的有效控制手段。

花生作为我国重要的粮油作物，或者直接食用，或者用于生产食用油，快速鉴定花生对黄曲霉浸染的抗性，对于有效控制花生产品安全具有重要意义。现有技术中鉴定花生对黄曲霉浸染的抗性通常采用的方法是，人工接种黄曲霉，培养适当时间后，用薄层色谱法或者高效液相色谱法测定样品中的黄曲霉毒素含量，该方法检测费用高、且耗费时间长；再者就是人工接种黄曲霉，培养适当时间后，观察花生被黄曲霉浸染的数量，该方法操作误差较大，上述两种方法均不利于快速鉴定。

发明内容

本发明提供的一种花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法及其应用，解决了现有技术中，用薄层色谱法或者高效液相色谱法测定样品中的黄曲霉毒素含量，该方法检测费用高、且耗费时间长；同时解决了直接观察花生被黄曲霉浸染数量的方法操作误差较大的问题。

本发明提供了一种花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1，黄曲霉菌株经活化后，洗脱黄曲霉孢子，制备成黄曲霉孢子悬浮液，备用；

步骤2，选择健康的花生种子，剥壳、去皮，然后粉碎成粉末，过40目筛，将得到的花生粉浸泡于体积分数为75％的乙醇中3-5min，然后无菌水冲洗干净，最后沥干水分，得到种子样品，备用；

步骤3，按以下结构制作培养装置：所述培养装置包括培养皿，围绕所述培养皿的内壁设有可拆卸的环形支架，并且所述环形支架放置于所述培养皿内底部，所述环形支架上搭接有水平的透明网格板，所述透明网格板为具有若干正方形格子的网状结构，且每个正方形格子的边长均相等；

步骤4，无菌条件下称取一定质量的种子样品，平铺于培养皿中，向培养皿中种子样品的中央滴加黄曲霉孢子悬浮液，种子样品位于透明网格板的下方，并与透明网格板之间留有一定距离；然后将培养装置于25-30℃暗培养3-7天，直至长出样品组霉菌圈，通过统计透明网格板上与样品组霉菌圈相对的正方形格子的数量，计算出样品组霉菌圈的面积A1，并予以记录；

步骤5，以等同于步骤4中所述种子样品质量的察氏培养基作为对照，操作与步骤4相同，区别仅在于：用察氏培养基培养黄曲霉，直至长出对照组霉菌圈，然后通过统计透明网格板上与对照组霉菌圈相对的正方形格子的数量，计算出对照组霉菌圈的面积C1，并予以记录；

步骤6，结果判断，通过黄曲霉感染指数F1评价种子样品对黄曲霉的浸染抗性：

其中，黄曲霉感染指数按以下公式计算：F1＝A1/C1。

优选的，上述花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法中，步骤1中，利用体积分数为5％的醋酸溶液洗脱黄曲霉孢子。

优选的，上述花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法中，步骤1中，黄曲霉孢子浓度为10⁵个/ml。

优选的，上述花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法中，步骤3中，每个正方形格子的边长为2-4mm。

优选的，上述花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法中，步骤3中，每25个正方形格子组成一个大方格，相邻两个大方格的共用边均设置为红色。

优选的，上述花生对黄曲霉侵染抗性的鉴定方法中，还包括黄曲霉毒素检测步骤，具体为：

步骤a，将步骤4长出样品组霉菌圈的培养装置置于365nm的紫外光下，观察样品组黄曲霉产生的黄曲霉毒素的荧光圈大小，通过统计透明网格板上与荧光圈相对的正方形格子的数量，计算出荧光圈的面积A2，并予以记录；

步骤b，将步骤5长出对照组霉菌圈的培养装置置于365nm的紫外光下，观察对照组黄曲霉产生的黄曲霉毒素的荧光圈大小，通过统计透明网格板上与荧光圈相对的正方形格子的数量，计算出荧光圈的面积C2，并予以记录；

步骤c，结果判断，通过黄曲霉毒素产生指数F2评价种子样品对黄曲霉的浸染抗性：

其中，黄曲霉毒素产生指数按以下公式计算：F2＝A2/C2。