[发明专利]柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法，包括以下步骤：构建HGT1蛋白表达框，HGT1蛋白表达框内包含组成型启动子、与组成型启动子连接的HGT1蛋白编码基因以及与HGT1蛋白编码基因连接的终止子；构建抗性基因表达框，抗性基因表达框内包含组成型启动子、与组成型启动子连接的hph基因以及与hph基因连接的终止子；将HGT1蛋白表达框和抗性基因表达框转化到霉菌中，得到重组霉菌。本发明同时提供一种采用上述方法构建的HGT1蛋白表达框和重组霉菌。本发明同时公开了一种采用上述方法构建的重组霉菌在发酵生产柠檬酸中的应用。本发明通过启动高亲和力葡萄糖转运蛋白表达，进而提高霉菌中柠檬酸的产量，且发酵时间大大缩短。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法及应用。

背景技术

黑曲霉是重要的工业生产菌，目前对黑曲霉进行代谢改造的研究集中于中心代谢通路和呼吸链的改造，包括糖酵解途径、TCA循环、rTCA循环的关键酶的单基因表达和基因协同表达，以及交替氧化酶的过量表达和敲除，但这些改造对柠檬酸产量的影响甚微，上述方法中只有增强rTCA循环途径促进了柠檬酸产量的提高。

在柠檬酸工业生产中，原料为淀粉，淀粉经过淀粉酶液化后过滤，得到清液和混液，通过清液和混液进行勾兑得到种子和发酵培养基，此时培养基中约一半的碳源为葡萄糖，另一半碳源以多聚葡萄糖的形式存在。而工业生产菌在发酵初期合成大量糖化酶，将多聚葡萄糖分解为葡萄糖，因此，在发酵前期培养基中碳源基本以葡萄糖的形式存在，所以柠檬酸发酵对碳源的吸收实际上是指对葡萄糖的吸收。

Torres测定了黑曲霉吸收葡萄糖存在2个Km值，分别为260μM和3.67mM，说明存在高亲和力和低亲和力两套转运系统，而且由低亲和力的转运系统提供柠檬酸发酵所需的代谢流，但该转运系统仅在葡萄糖浓度>50g·L^-1时起作用。因葡萄糖的转运是柠檬酸发酵的第一个步骤，该转运系统对柠檬酸发酵有直接的影响，因此调整柠檬酸发酵生产过程中的葡萄糖转运系统，有可能增强柠檬酸的产量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法及应用，通过启动高亲和力葡萄糖转运蛋白的表达，以增强葡萄糖在发酵后期的吸收，进而提高了霉菌中柠檬酸的发酵产量。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

在一方面，本发明提供了一种柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建HGT1蛋白表达框，HGT1蛋白表达框包含组成型启动子、与组成型启动子连接的HGT1蛋白编码基因以及与HGT1蛋白编码基因连接的终止子；

(2)构建抗性基因表达框，抗性基因表达框包含组成型启动子、与组成型启动子连接的hph基因以及与hph基因连接的终止子；

(3)将步骤(1)HGT1蛋白表达框和步骤(2)得到的抗性基因表达框转化到霉菌中，得到重组霉菌。

进一步地，在步骤(1)中，HGT1蛋白编码基因来源于黑曲霉。

进一步地，在步骤(1)中，HGT1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，HGT1蛋白编码基因具有转运葡萄糖的功能，其编码的氨基酸序列可发生1个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。

优选地，HGT1蛋白编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，在步骤(1)中和步骤(2)中，组成型启动子为PgpdA启动子、gpdA启动子、Pmbf启动子或Pgla启动子。

进一步地，PgpdA启动子的序列如SEQ ID NO.3所示。